红嘴鸥TLR7蛋白克隆表达及多抗制备制造技术

本发明专利技术涉及红嘴鸥TLR7蛋白克隆表达及多抗制备，属于生物工程技术领域，本发明专利技术通过对红嘴鸥疾病免疫相关蛋白TLR7基因进行生物信息学分析、构建原核表达载体制备多克隆抗体，为红嘴鸥TLR7基因的固有免疫作用及机制的深入了解提供依据。本发明专利技术制备得到的抗体特异性较强，TLR7基因的多克隆抗体制备为进一步研究TLR7蛋白的功能提供依据。

【技术实现步骤摘要】
红嘴鸥TLR7蛋白克隆表达及多抗制备
本专利技术属于生物工程
，具体的说，涉及红嘴鸥TLR7蛋白克隆表达及多抗制备。
技术介绍
Toll样受体是目前发现能调控机体免疫反应的一类重要模式识别受体，不仅能识别病原微生物调控免疫应答反应，启动固有免疫机制，其引发的信号通路还能引起适应性免疫反应的活化。Toll样受体7(Tolllikereceptor7，TLR7)定位于X染色体，存在三个外显子，广泛存在于多种细胞，在细胞内体-溶酶体中进行表达。经激活后的TLR7基因可招募MyD88蛋白，经效应分子激活两个主要的信号通路(NF-KB和IRF)，促进前炎性细胞因子和干扰素的产生。TLR7基因的主要生物学功能是对病毒单链RNA进行识别，在抗病毒过程中介导免疫应答的产生，对治疗各种动物及人类的病毒性感染疾病有着极大意义。同时，TLR7基因在免疫缺陷性疾病、抗肿瘤研究、免疫调节反应、介导细胞凋亡等方面也具有重要功能。红嘴鸥是分布于欧亚大陆和北美洲东部沿海的一种候鸟。每年冬天大量的红嘴鸥从北方西伯利亚地区迁徙到中国南方越冬，其越冬地分布广泛。候鸟的迁徙与多种流行性疾病存在密切联系。TLR7基因功能研究为进一步了解畜禽感染病毒后抗病毒机制研究提供保证，目前较多集中于家禽和家畜TLR7基因的功能研究，但关于野生动物尤其是野生鸟类(如红嘴鸥)TLR7基因功能研究还未有报道，如将其作为研究突破口，可以为野生鸟类先天免疫系统进一步研究奠定重要的理论基础。Toll样受体家族作为一种膜表面分子，对早期宿主防御过程中病原入侵起至关作用。先天免疫系统的细胞表达模式识别受体PRR会通过病原体相关分子模式识别各种病原体，同时受体PRR能被微生物配体激活诱导产生级联信号转导。目前研究较集中在哺乳动物方面，已发现13种哺乳动物的TLRs，相对而言禽TLRs的研究报道较少。对已鉴定的TLR进行生物学比较发现，TLR家族成员的功能域具有高度保守性。但物种不同，TLR受体的种类与特性会有差异。Toll样受体7(TLR7)是主要的模式识别受体PRR，能识别单链RNA病毒，参与抗病毒感染。TLR7基因能识别流感病毒或新城疫病毒，当机体感染病毒后，TLR7基因被激活，以MyD88(髓样分化因子)依赖的信号通路激活免疫细胞使信号下传，通过激活干扰素调节因子7(IRF7)诱导I型干扰素的分泌，参与抗病毒感染。对于野生鸟类TLR7基因的报道较少，由于物种的不同该基因的获得更为较难，该基因同源性较低，导致在PCR扩增中引物的特异性至关重要，否则难以扩增获得该基因，本研究客服扩增困难，获得该基因全序列，并体外构建表达载体，获得重组蛋白及多克隆抗体，为后期疾病防制及机理研究提供重要基础。
技术实现思路
为了克服
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提供了红嘴鸥TLR7蛋白克隆表达及多抗制备，通过对红嘴鸥疾病免疫相关蛋白TLR7基因进行生物信息学分析、构建原核表达载体制备多克隆抗体，为红嘴鸥TLR7基因的固有免疫作用及机制的深入了解提供依据。为实现上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术提供了一种红嘴鸥TLR7蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供了一种编码红嘴鸥TLR7蛋白的基因，所述基因编码如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了一种红嘴鸥TLR7克隆表达的方法，包括以下步骤：1)分离红嘴鸥血液淋巴细胞，提取总RNA，将RNA反转录为cDNA；2)设计特异性引物，上下游引物的两个酶切位点分别为EcoRI和XhoI，PCR扩增获得红嘴鸥TLR7基因；3)将pMD18-T载体与纯化的TLR7基因进行连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行培养，将培养后的菌液提取核酸后采用PCR及EcoRI与XhoI双酶切方法进行双重鉴定，获得重组质粒pMD18-T-TLR7；4)用EcoRI与XhoI酶切重组质粒pMD18T-TLR7，获得目的片段TLR7。所述的红嘴鸥TLR7克隆表达的方法，还包括以下步骤：5)重组原核表达载体的构建将TLR7目的片段插入pET32a(+)载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，构建得到重组原核表达载体pET32a-TLR7。进一步优选，步骤2)中，特异性引物序列如下：上游引物T1：GAATTCATGGGTTGTGCTCTAATCCT，下游引物T2：CTCGAGCTAAACAGTTTCTTGGAGTA；扩增片段长度为1182bp。进一步优选，步骤2)中，PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延展1min，40个循环；72℃延展10min。本专利技术提供了一种红嘴鸥TLR7蛋白的制备方法，将上述制备的红嘴鸥TLR7重组原核表达载体转化至TransettaDE3表达宿主菌中，经IPTG诱导表达，获得红嘴鸥TLR7重组蛋白。进一步优选，菌液OD600值0.6时，诱导表达条件为加入1.0mmol/lIPTG于30℃条件下诱导表达5h。本专利技术提供了一种红嘴鸥TLR7多克隆抗体的制备方法，将上述获得的红嘴鸥TLR7蛋白作为抗原免疫兔子，接种方法如下：1)免疫原的制备：取纯化的重组蛋白复性后，与弗氏佐剂等体积混合、乳化后作为免疫原；2)免疫程序：一免：完全佐剂+抗原，抗原剂量2mL/只(1.0mg/mL)，背部皮下多点注射；首免后7天，进行二免：不完全佐剂+抗原，抗原剂量1mL/只(0.5mg/mL)，背部皮下多点注射；首免后14天，进行三免：不完全佐剂+抗原，抗原剂量1mg/只(0.5mg/mL)，背部皮下多点注射；3)三免结束后10天颈动脉放血，分离血清即可得多克隆抗体。本专利技术提供了一种红嘴鸥TLR7多克隆抗体，该多克隆抗体根据权利要求9的方法制备得到。本专利技术的有益效果：本专利技术通过对红嘴鸥疾病免疫相关蛋白TLR7基因进行生物信息学分析、构建原核表达载体制备多克隆抗体，为红嘴鸥TLR7基因的固有免疫作用及机制的深入了解提供依据。附图说明图1是N-糖基化位点预测结果。图2是磷酸化位点预测结果。图3是跨膜区预测结果。图4是信号肽切割位点预测结果。图5是疏水性预测结果。图6是PCR扩增TLR7基因；其中，M：DL2000DNAmarker，1：TLR7基因PCR扩增片段。图7是PCR扩增TLR7基因；其中，M：DL2000DNAmarker，1：TLR7基因PCR扩增片段。图8是T克隆重组质粒pMD18-T-TLR7的双酶切鉴定；其中，M：DL2000DNAmarker，1：pMD18-T-TLR7质粒，2：pMD18-T-TLR7质粒双酶切。图9是重组表达质粒pET32a-TLR7酶切鉴定；其中，M1：DL2000DNAmarker，M1：DL15000DNAmarker，1：pE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种红嘴鸥TLR7蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种红嘴鸥TLR7蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种编码红嘴鸥TLR7蛋白的基因，其特征在于：所述基因编码如权利要求1所述蛋白的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.一种红嘴鸥TLR7克隆表达的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）分离红嘴鸥血液淋巴细胞，提取总RNA，将RNA反转录为cDNA；
2）设计特异性引物，上下游引物的两个酶切位点分别为EcoRI和XhoI，PCR扩增获得红嘴鸥TLR7基因；
3）将pMD18-T载体与纯化的TLR7基因进行连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行培养，将培养后的菌液提取核酸后采用PCR及EcoRI与XhoI双酶切方法进行双重鉴定，获得重组质粒pMD18-T-TLR7；
4）用EcoRI与XhoI酶切重组质粒pMD18T-TLR7，获得目的片段TLR7。


4.根据权利要求3所述的红嘴鸥TLR7克隆表达的方法，其特征在于：还包括以下步骤：
5）重组原核表达载体的构建
将TLR7目的片段插入pET32a(+)载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，构建得到重组原核表达载体pET32a-TLR7。


5.根据权利要求3或4所述的红嘴鸥TLR7克隆表达的方法，其特征在于：步骤2）中，特异性引物序列如下：
上游引物T1：GAATTCATGGGTTGTGCTCTAATCCT，
下游引物T2：CTCGAGCTAAACAGTTTCTTGGAGTA；扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：常华，项勋，代飞燕，段纲，杨林富，段博芳，曾邦全，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53