一种连续流固相反应制备索马鲁肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种连续流固相反应制备索马鲁肽的方法，先将Octadecanedioic(OtBu)acid‑γ‑Glu‑(OtBu)‑AEEA‑AEEA引入到Lys26的侧链再完成主链的策略；主链构造采用Fmoc‑Gly‑树脂，第三肽树脂和第四肽树脂，索马鲁肽肽链增长采用连续流固相合成。

【技术实现步骤摘要】
一种连续流固相反应制备索马鲁肽的方法
本专利技术属于多肽药物合成领域，具体涉及一种结合连续流固相合成系统制备索马鲁肽的方法。
技术介绍
索马鲁肽是一种长效GLP-1受体激动剂，每周只须注射1次。它是继艾塞那肽、利拉鲁肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利司那肽、贝那鲁肽之后，全球第7个上市的GLP-1受体激动剂。索马鲁肽降糖和减肥双重疗效，2型糖尿病患者接受每周1次索马鲁肽注射治疗后的降糖和减重效果明显优于安慰剂、西格列汀、甘精胰岛素U100或缓释艾塞那肽。索马鲁肽在减肥方面的表现甚至优于同门药物Saxenda（利拉鲁肽3mg）。索马鲁肽的多肽序列如下：H-His7-Aib8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcid)-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Arg34-Gly35-Arg36-Gly37-OH其中，Lys26(AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcid)结构示意图如下：目前主要通过间歇性固相合成法制备长链多肽药物。早在20世纪80年代已经提出连续方法固相合成法（J.Chem.Soc.PerkinTrans.I125-147，1986；TetrahedronLetters,Vol.28,38,4469-4472,1987）。但是由于当时使用传统的多肽合成树脂，树脂溶胀性不高，连续流合成条件下树脂表面的活性基团不易参与反应，同时柱内压力太高容易出现氨基酸消旋，导致合成效果远远不如间歇性固相合成法。溶胀性好的树脂出现后，连续流固相合成技术也没有引起业界重视。最近文献(Continuous-FlowSolid-PhasePeptideSynthesis:ARevolutionaryReductionoftheAminoAcidExcess，ChemSusChem2014,7,3172–3176)报道利用连续流工艺结合优良溶胀性的树脂合成多肽，相对于间歇性方法该工艺在节省时间、产品质量、节约氨基酸和溶剂方面表现出非常突出的效果。连续流固相多肽合成工艺用于多肽药物合成目前报道还很少。微反应器将连续通过的保护氨基酸快速加热并完全活化的技术与连续流固相多肽合成相结合的工艺用来制备索马鲁肽也未见公布。已经公布的合成工艺全部集中在间歇性固相合成法和固液结合法方面。现有公布的合成索马鲁肽的方法分为几种途径。1）通过多肽固相合成，按照多肽序列中氨基酸顺序逐一完成索马鲁肽的肽链连接，相关文献比如CN106928343A、CN109456402A、US20180057558A1等。此类方法以Lys26为支点，从Lys26的主链胺基往下连先完成多肽主链，然后在Lys26的侧链引入AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcid，另外的方法是先从Lys26的侧链胺基引入AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcid完成多肽主链，然后再从Lys26的主链胺基往下完成H-His7-Aib8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25部分的连接。此类方法通过传统的WangPS树脂或者CTCPS树脂来合成索马鲁肽，会出现肽链偶联时间长、肽链偶联不完全，粗品纯度低等问题。多肽合成当中微波辅助，在实际放大生产当中具有局限性。2）固相片段合成法，即在连接多肽的时候，把短肽通过固相合成方法引入索马鲁肽主肽链上，相关文献有CN109021092A、CN108676087A等。此类方法巧妙地解决了缺失肽、肽链折叠等问题，但是同样面临肽链偶联时间偏长、多肽差向异构化严重、溶剂和氨基酸消耗过大的问题。3）固液结合法，通过固相方法合成出特定的片段，再将片段用液相合成连接成整条肽链（见CN106749613A）。本方法同样需要通过固相合成制备短肽，不能从根本上提高索马鲁肽的产能，其次液相合成时将小片段、缩合试剂和杂质与主片段分离会是一个非常繁琐的工作，尤其是多肽片段溶解性好，不能像保护氨基酸那样通过调溶液的酸碱被大部分除去，纯化工，作难度大，实际效率很低。通常氨基酸数量大于10个时，平均每步多肽偶联未完成率达到1%，当氨基酸数量大于20个时，平均每步多肽偶联未完成率达到2%（《固相有机合成.原理及应用指南》王德心），逐步偶联法合成索马鲁肽势必造成粗产品总收率低于50%，这对于工业化生产是不可取的。但是过分追求片段法，片段的物料成本相比单个氨基酸偶联高，效率低很多。同时片段偶联存在时间长，偶联不易完全的情况。多肽粗品纯化的成本较高，如果能够做到主峰前后一分钟无杂峰，纯化上样量可以做得较大，重复纯化次数少，这将大幅降低纯化成本。如下2种方法可以提高粗品产量和降低纯化成本：1）即使氨基酸个数大于20个时，平均每步多肽偶联未完成率小于0.5%。2）偶联最后几步采用长的并且高纯度多肽片段与主链缩合，以此在HPLC上拉开主产品与杂质的距离。本专利技术通过这2个方法，可以高效地制备低成本的索马鲁肽及其它多肽药物。
技术实现思路
本方法合成索马鲁肽主链构造采用Boc-His(x)-Aib-Glu(OtBu)-Gly，Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-OH，H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-(γ-Glu-(OtBu))-monoButylOctadecanate)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂片段，同时利用Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-Arg(y)-Gly-OH参与片段或主链的制备。其中Lys26的侧链通过Fmoc-Ala-Ala-Lys(Mtt)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂片段与Octadecanedioic(OtBu)acid-γ-Glu-(OtBu)-AEEA-AEEA-OH反应引入。多肽固相合成树脂表面引入连接子(Linker)得到Linker-PEG-PS树脂、Linker-PEGA、Linker-ChemMatrix等。Linker-PEG-PS树脂结合连续流固相合成索马鲁肽表现出超高效、低成本等优点。常规的Wang树脂运用连续流固相合成工艺同样适合制备索马鲁肽。本专利技术中所用的连续本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种连续流固相反应制备索马鲁肽的方法，其特征在于，制备步骤如下：/n步骤1：将Fmoc-Gly-OH与带有多肽合成连接子的多肽合成树脂进行反应，制得Fmoc-Gly-树脂；/n步骤2：将Fmoc-Gly-树脂通过连续流固相多肽合成工艺制备得到Fmoc-Ala-Ala-Lys(Mtt)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂；/n步骤3：将步骤2制备得到的多肽树脂通过连续流固相多肽合成工艺，将酸性溶液脱除Mtt保护基得到/nFmoc-Ala-Ala-Lys-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂；/n步骤4：将步骤3制备得到的多肽树脂通过连续流固相多肽合成工艺制备得到Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-(γ-Glu-(OtBu))-monoButyl Octadecanate)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂；/n步骤5：将步骤4制备得到的多肽树脂通过连续流固相多肽合成工艺制备得到H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-(γ-Glu-(OtBu))-monoButyl Octadecanate)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂；/n步骤6：将步骤5制备得到的多肽树脂利用连续流固相多肽合成工艺制备Boc-His(x)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-(γ-Glu-(OtBu))-monoButyl Octadecanate)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂；/n步骤7：将步骤6制备得到的多肽树脂进行切割得到索马鲁肽粗品，索马鲁肽粗品经过纯化、脱盐、冻干后得到索马鲁肽成品。/n...

【技术特征摘要】
1.一种连续流固相反应制备索马鲁肽的方法，其特征在于，制备步骤如下：
步骤1：将Fmoc-Gly-OH与带有多肽合成连接子的多肽合成树脂进行反应，制得Fmoc-Gly-树脂；
步骤2：将Fmoc-Gly-树脂通过连续流固相多肽合成工艺制备得到Fmoc-Ala-Ala-Lys(Mtt)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂；
步骤3：将步骤2制备得到的多肽树脂通过连续流固相多肽合成工艺，将酸性溶液脱除Mtt保护基得到
Fmoc-Ala-Ala-Lys-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂；
步骤4：将步骤3制备得到的多肽树脂通过连续流固相多肽合成工艺制备得到Fmoc-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-(γ-Glu-(OtBu))-monoButylOctadecanate)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂；
步骤5：将步骤4制备得到的多肽树脂通过连续流固相多肽合成工艺制备得到H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-(γ-Glu-(OtBu))-monoButylOctadecanate)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂；
步骤6：将步骤5制备得到的多肽树脂利用连续流固相多肽合成工艺制备Boc-His(x)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(Psi(me.me)Pro)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-(γ-Glu-(OtBu))-monoButylOctadecanate)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(y)-Gly-Arg(y)-Gly-树脂；
步骤7：将步骤6制备得到的多肽树脂进行切割得到索马鲁肽粗品，索马鲁肽粗品经过纯化、脱盐、冻干后得到索马鲁肽成品。


2.根据权利要求1所述的一种连续流固相反应制备索马鲁肽的方法，其特征在于，步骤1中多肽合成树脂为聚乙二醇修饰后的树脂、聚乙二醇基质树脂或Wang树脂。


3.根据权利要求2所述的一种连续流固相反应制备索马鲁肽的方法，其特征在于，聚乙二醇修饰后的树脂具有如化学式1~13所示的结构：















其中，Re为聚苯乙烯树脂、聚丙烯酰胺树脂或聚甲基丙烯酸酯树脂，R为氢、甲基、乙基、异丙基或苄基；n为1~3的整数；m为4~80的整数，q为1~9的整数；
M具有如化学式14~22所示的结构：





















其中，n1为1-8的整数，s为1-2的整数，m1为0-10的整数，r为1-3的整数，t为1-7的整数，g为0-2的整数。


4.根据权利要求2所述的一种连续流固相反应制备索马鲁肽的方法，其特征在于，聚乙二醇基质树脂具有如化学式23-26...

【专利技术属性】
技术研发人员：向双春，高峰，刘聪翀，李云平，
申请(专利权)人：苏州金顶生物有限公司，大连阿拉宁生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32