制备胰高血糖素肽制造技术

本发明专利技术涉及一种纯化胰高血糖素肽的方法，所述方法包含二维反相高效液相色谱方案，其中使用包含磷酸三乙铵(TEAP)缓冲液和乙腈的移动相进行第一步骤，且使用包含乙酸水溶液和乙腈的移动相进行第二步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备胰高血糖素肽本专利技术大体上涉及以工业或实验室规模制备肽的领域。本专利技术涉及有效合成和纯化胰高血糖素肽的方法。人类胰高血糖素是GCG基因(HGNC：4191)的产物。所述肽具有3482.80g/mol的平均分子量，且由以单字母代码书写的以下29个氨基酸的序列组成：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO:1)内分泌胰高血糖素由胰腺的α细胞产生，且为中枢分解代谢激素。胰高血糖素用作药物，尤其用作严重低血糖症的紧急治疗。出于治疗性目的，首先从牛和猪的胰腺提取和纯化胰高血糖素。如今，大多通过重组技术(并且最近也通过化学肽合成)以工业规模生产胰高血糖素。化学肽合成已广泛地描述于文献中。化学肽合成的两种标准方法比较突出，即液相肽合成(liquidphasepeptidesynthesis,LPPS)和固相肽合成(solidphasepeptidesynthesis,SPPS)。此外，可利用混合式方法，其中首先由以上技术中的一种合成片段且接着使用另一种技术接合在一起。LPPS(也称为液相肽合成)在同质反应介质中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备胰高血糖素肽的方法，包括：/na)提供包含胰高血糖素肽和至少一种非所需组分的液体组合物C；/nb)对所述组合物C进行第一反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，其中烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用包含磷酸三乙铵和乙腈的水性移动相，且通过逐渐增加所述移动相内的所述乙腈浓度，同时收集含有所述胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱；和/nc)对步骤b)中获得的、收集的含有胰高血糖素肽的洗脱份进行第二反相HPLC纯化，其中烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用包含乙酸和乙腈的移动相，且通过逐渐增加所述移动相内的所述乙腈浓度，同时收集含有纯化的胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180130 EP 18154113.71.一种制备胰高血糖素肽的方法，包括：
a)提供包含胰高血糖素肽和至少一种非所需组分的液体组合物C；
b)对所述组合物C进行第一反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，其中烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用包含磷酸三乙铵和乙腈的水性移动相，且通过逐渐增加所述移动相内的所述乙腈浓度，同时收集含有所述胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱；和
c)对步骤b)中获得的、收集的含有胰高血糖素肽的洗脱份进行第二反相HPLC纯化，其中烃键合的二氧化硅被用作固定相，使用包含乙酸和乙腈的移动相，且通过逐渐增加所述移动相内的所述乙腈浓度，同时收集含有纯化的胰高血糖素肽的洗脱份来实现洗脱。


2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)中所用的磷酸三乙铵缓冲液的pH为6.5-7.5，和/或其中步骤c)的所述移动相中所述乙酸的浓度为0.5至5％(v/v)，和/或其中步骤b)中的洗脱是通过将所述乙腈含量从2至4％(v/v)乙腈增加至30至50％(v/v)乙腈的梯度来实现，和/或其中步骤c)中的洗脱是通过将所述乙腈含量从2至4％(v/v)乙腈增加至40至60％(v/v)乙腈的梯度来实现。


3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中C18键合的二氧化硅被用作步骤b)和/或步骤c)中的固定相，和/或其中相同固定相用于步骤b)和c)中，优选地，其中相同柱用于步骤b)和c)。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，进一步包括在装载液体组合物C之前和/或在装载步骤b)中获得的收集的含有胰高血糖素肽的洗脱份之前，用包含TFA和乙腈的水溶液冲洗所述固定相的步骤。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：
d)进行阴离子交换，优选地，其中乙酸根至少部分被氯离子置换，和/或其中通过冻干、超滤、透析、固相萃取、反相色谱或通过离子交换色谱来实现所述阴离子交换。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤a)包括：
(a-i)提供与固相结合的胰高血糖素肽，其中至少Glu、Asp和Lys的侧链带有保护基；和
(a-ii)将所述胰高血糖素肽从所述固相裂解且从所述胰高血糖素肽去除所述保护基。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述与固相结合的胰高血糖素肽包含两个假脯氨酸二肽，优选地，其中所述两个假脯氨酸二肽在与选自由以下组成的群组的位置对应或相同的位置处引入：SEQIDNO:1的肽的Gly4-Thr5和Phe6-Thr7、Gly4-Thr5和Thr7-Ser8、Gly4-Thr5和Tyr10-Ser11、Gly4-Thr5和Asp15-Ser16、Phe6-Thr7和Tyr10-Ser11、Phe6-Thr7和Asp15-Ser16、Thr7-Ser8和Tyr10-Ser11、Thr7-Ser8和As...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉尔夫·艾森胡特，根特·洛伊德尔，丹尼尔·萨姆森，拉尔夫·O·舍恩莱博，
申请(专利权)人：巴赫姆控股股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH