利拉鲁肽、索马鲁肽和GLP-1的化学酶促合成制造技术

本发明专利技术涉及用于合成包含序列His‑X‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Y‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Z‑Gly‑Arg‑Gly的肽的方法，所述方法包括将以下(a)和(b)酶促偶联：(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一肽片段包含序列His‑X‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑(硫)酯，和(b)具有包含第二肽片段的N‑末端未保护的胺的肽亲核试剂，所述第二肽片段包含序列H‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Y‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Z‑Gly‑Arg‑Gly；其中X是Ala或α‑氨基‑异丁酸(Aib)残基，Y是Lys，所述Lys具有游离侧链ε‑氨基基团，或所述Lys的侧链ε‑氨基基团被保护基团保护，或所述Lys的侧链ε‑氨基基团被氨基酸或另一种官能团官能化，Z是Arg或Lys。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利拉鲁肽、索马鲁肽和GLP-1的化学酶促合成本专利技术涉及一种方法，其中在连接酶的存在下以酶促方式进行肽片段偶联以合成包含序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly的肽。包含氨基酸序列H-His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly-OH的几种肽是本领域所熟知的促胰岛素肽。这些肽包括GLP-1、利拉鲁肽(Liraglutide)和索马鲁肽(Semaglutide)。人GLP-1(胰高血糖素样肽-1)具有式H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH。利拉鲁肽是在上述序列的位置20中的赖氨酸的ε-氨基基团上被Glu间隔的棕榈酸取代的Arg20-GLP-1类似物。因此，利拉鲁肽具有式H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-γ-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH(也参见图1，所有手性氨基酸残基都是L-氨基酸残基)。在Lys(Pal-γ-Glu)中，Lys残基的ε-氨基-基团与γ-Glu羧基侧链链接，并且Glu被N-棕榈酰化。索马鲁肽具有式H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-17-羧基十七烷酰基)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。本文的AEEA-AEEA-γ-Glu-17-羧基十七烷酰基是N-(17-羧基-1-氧代十七烷基)-L-γ-谷氨酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基(也参见图2，所有手性氨基酸残基都是L-氨基酸残基)。这些肽可以例如在II型糖尿病的治疗中使用。此外，例如，利拉鲁肽可以作为在成人患者中用于慢性体重管理的减少的热量饮食和增加的体力活动的注射用辅助剂在肥胖症的治疗中使用。本领域已知合成肽(包括寡肽，像GLP-1、利拉鲁肽和索马鲁肽)的方法。在WO2007147816和WO2016/046753中描述了合成促胰岛素肽(例如GLP-1和其类似物)的方法。在WO2016/046753的“专利技术背景”中，给出了合适的制备方法(特别是重组方法)的详细描述，在固体支持物上的顺序合成，利拉鲁肽的固相合成，包括将含有氨基酸残基(1-10)的肽序列与含有氨基酸残基(11-31)的序列偶联，或利拉鲁肽的固相合成，包括制备含有氨基酸残基(1-4)、(15-16)和(17-31)的肽序列，在与含有氨基酸序列(1-4)的肽偶联之前，将含有氨基酸残基(15-16)的肽与(17-31)偶联，并且顺序添加氨基酸。根据WO2016/046753，在包括液相或固相肽合成或其组合的方法中制备GLP-1肽，其中该方法包括最终的偶联步骤，其中将至少两个片段在末端Gly残基处偶联，并且其中至少一个片段是通过偶联至少两个亚片段制备的。利拉鲁肽特别是通过偶联His-Ala-Glu-Gly和Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OX)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH获得的。在此序列中，X表示H或Gluα-羧酸基团的保护基团。如从WO2016/046753的“专利技术背景”得出，仍然需要发现新的用于合成GLP-1蛋白质(例如利拉鲁肽或索马鲁肽)的方法，以提供更好、更有效和/或更便宜的方法，或提供可以更易于纯化的产物以获得具有改善的产率和纯度的产物。特别地，这表示需要提供特别是在工业规模上制备GLP-1和类似物(例如利拉鲁肽或索马鲁肽)的方法，该方法不应要求以高产率而使用有毒或其他不良试剂，并且可以易于纯化以获得高纯度的产物。在WO2007147816和WO2016/046753中均未建议GLP-1或其类似物(像利拉鲁肽或索马鲁肽)的酶促合成，其均集中于化学合成。然而，如以上引用的现有技术中所讨论的，肽的完全化学合成具有缺点。此外，由于副反应，长于15个氨基酸的肽通常很难在固相上合成。结果是，纯化是麻烦的。因此，长于10个氨基酸的肽通常是通过以下方式合成的：侧链保护的寡肽片段的固相合成的组合，这些寡肽片段随后在溶液中经历化学缩合，例如以10+10缩合以生成20个氨基酸的肽。化学侧链保护的寡肽片段缩合的主要缺点是，在激活该酰基供体的C末端氨基酸残基后，会发生外消旋作用。相反，酶催化的肽偶联完全没有外消旋作用，并且与化学肽合成相比具有若干其他优点，例如在侧链官能团上不存在副反应。对于工业应用而言，基于动力学方法(即，使用酰基供体C末端酯)的酶促肽合成概念最具有吸引力(参见例如N.Sewald和H-D.Jakubke,“Peptides:ChemistryandBiology[肽：化学和生物学]”，第一次重印版Wiley-VCHVerlagGmbH,Weinheim[魏因海姆]2002)。水溶液中酶促偶联的问题是水的存在趋向于促进水解而不是偶联。已经公开了关于寡肽片段在水溶液中的酶促缩合的一些报道(Kumaran等人ProteinScience[蛋白质科学],2000,9,734；等人Bioorg.Med.Chem[生物有机与药物化学快报].1998,6,891；Homandberg等人Biochemistry[生物化学],1981,21,3387；Komoriya等人Int.J.Pep.Prot.Res.[国际肽与蛋白质研究杂志]1980,16,433)。Wells等人发现(US5,403,737)，通过改变枯草杆菌蛋白酶BPN’(来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(SEQIDNO:2))的活性位点，可以显著改善水溶液中寡肽的酶促缩合。当引入两个突变即S221C和P225A时，获得了一种枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，称为subtiligase，与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’相比，其合成/水解比率(S/H比率)增加了500倍。在进一步的实验中，Wells等人向subtiligase添加了另外五个突变，以使该酶更稳定(Proc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于合成肽的方法，所述肽包含序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly，所述方法包括将以下(a)和(b)酶促偶联：/n(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一肽片段包含序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯；以及/n(b)具有包含第二肽片段的N末端未保护的胺的肽亲核试剂，所述第二肽片段包含序列H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly/n其中/n-X是Ala或α-氨基-异丁酸(Aib)残基；/n-Y是Lys，所述Lys具有游离侧链ε-氨基基团或所述Lys的侧链ε-氨基基团被保护基团保护或所述Lys的侧链ε-氨基基团被氨基酸或另一种官能团官能化，特别是选自由以下组成的组的官能团官能化：γ-Glu-OH、Pal-γ-Glu-OH、AEEA-AEEA-γ-Glu-OH和AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH，/n其中Pal是棕榈酰基并且AEEA-AEEA是-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基；/n-Z是Arg或Lys；/n所述酶促偶联通过连接酶进行催化。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180309 EP 18161084.11.一种用于合成肽的方法，所述肽包含序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly，所述方法包括将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一肽片段包含序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯；以及
(b)具有包含第二肽片段的N末端未保护的胺的肽亲核试剂，所述第二肽片段包含序列H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly
其中
-X是Ala或α-氨基-异丁酸(Aib)残基；
-Y是Lys，所述Lys具有游离侧链ε-氨基基团或所述Lys的侧链ε-氨基基团被保护基团保护或所述Lys的侧链ε-氨基基团被氨基酸或另一种官能团官能化，特别是选自由以下组成的组的官能团官能化：γ-Glu-OH、Pal-γ-Glu-OH、AEEA-AEEA-γ-Glu-OH和AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH，
其中Pal是棕榈酰基并且AEEA-AEEA是-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基；
-Z是Arg或Lys；
所述酶促偶联通过连接酶进行催化。


2.根据权利要求1所述的方法，其中合成的所述肽是利拉鲁肽。


3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括通过连接酶催化将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)包含以下序列的肽C末端酯或硫酯：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和
(b)包含以下序列的肽亲核试剂：H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是Lys(Pal-γ-Glu-OH)。


4.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括通过连接酶催化将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)由式P-Wv-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯表示的肽C末端酯或硫酯，
其中P是保护基团，v是具有至少为0的值的整数，优选为1-5，更优选为1-3，最优选为1，并且每个W独立地表示相同的或不同的氨基酸残基，和
(b)包含以下序列的肽亲核试剂：H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly；并且然后
提供所述具有棕榈酰基基团(Pal)的Lys(γ-Glu-OH)。


5.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括通过连接酶催化将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)包含以下序列的肽C末端酯或硫酯：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和
(b)包含以下序列的肽亲核试剂：H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是具有游离ε-氨基侧链的赖氨酸残基；并且然后提供所述具有Pal-γ-Glu-OH的氨基侧链。


6.根据权利要求1所述的方法，其中合成的所述肽是索马鲁肽。


7.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括通过连接酶催化将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)包含以下序列的肽C末端酯或硫酯：His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和
(b)包含以下序列的肽亲核试剂：H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH)。


8.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·简·伦纳德·马里奥·夸德弗莱格，安娜·托普拉克，蒂莫·努詹斯，
申请(专利权)人：恩细贝普有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL