一种苋菜重组抑菌蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种苋菜抑菌蛋白AmaAAP，所述苋菜抑菌蛋白AmaAAP的氨基酸序列为SEQ ID No:1；本发明专利技术还公开了一种编码所述苋菜抑菌蛋白AmaAAP的基因，所述苋菜抑菌蛋白AmaAAP基因的核苷酸序列为SEQ ID No:2；本发明专利技术还公开一种基于所述苋菜抑菌蛋白AmaAAP的重组抑菌蛋白rAmaAAP；本发明专利技术还公开了所述重组抑菌蛋白rAmaAAP在制备防控辣椒疫霉病药物中的应用；本发明专利技术还公开了所述重组抑菌蛋白rAmaAAP在制备防控水稻纹枯病药物中的应用；本发明专利技术还公开了该重组抑菌蛋白rAmaAAP的制备方法。本发明专利技术利用毕赤酵母生产重组蛋白，具有分泌型表达的优势，易于工业化生产以及为设计生物农药的剂型提供更多选择。

【技术实现步骤摘要】
一种苋菜重组抑菌蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及植物病害生物防治领域，尤其涉及一种苋菜重组抑菌蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)引起的辣椒疫霉病是一种危害辣椒、番茄、黄瓜等作物生长的毁灭性病害，是世界性的土传病害，每年因此造成的经济损失达上10亿美元。目前对辣椒疫霉病的防治主要采用化学杀菌剂(甲霜灵，丁基吡咯啉和氟噻唑酮等)结合栽培管理措施(种植抗病品种、轮作等)来进行。水稻纹枯病是水稻生产上普遍发生的一种世界性真菌病害，由立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起，该病使水稻不能抽穗，或抽穗的瘪谷较多，粒重下降，严重影响水稻产量。防治该病的药剂以井冈霉素为主，但长期单一使用也造成抗药性增加的问题。因此，寻找新的具有抑制这两种病原菌活性的植物源天然物质来控制病害的发生对蔬菜产业和水稻产业的发展具有重大的环保价值。核糖体失活蛋白广泛存在与高等植物体内，可以给植物提供对真菌和病毒的广谱抗性，主要通过N-糖苷酶活性和RNA水解酶活性来行使功能。早在19世纪末就从蓖麻中分离到了第一个核糖体失活蛋白-蓖麻毒蛋白(ricin)，迄今为止已经从多种植物中检测到。苋菜作为一种苋科植物，已经从中分离纯化出了多种抑菌成分，如可作用于细菌的类黄酮类、萜类和有机酸类等，可作用于真菌的苋菜种子中的抗菌肽类。目前，还尚未见采用苋菜核糖体失活蛋白基因作为植物源抑菌剂在防控辣椒疫霉病和水稻纹枯病上的报导。
技术实现思路
为了解决上述相关领域的不足，本专利技术提供一种苋菜重组抑菌蛋白及其制备方法和应用。本专利技术的一种苋菜重组抑菌蛋白及其制备方法和应用是通过以下技术方案实现的：一种苋菜抑菌蛋白AmaAAP，所述苋菜蛋白AmaAAP的氨基酸序列为SEQIDNo:1。编码上述一种苋菜抑菌蛋白AmaAAP的基因，所述苋菜蛋白AmaAAP基因的核苷酸序列为SEQIDNo:1。一种含有上述苋菜抑菌蛋白AmaAAP基因的表达载体。一种基于苋菜蛋白AmaAAP的重组抑菌蛋白rAmaAAP，所述重组抑菌蛋白rAmaAAP为：由所述SEQIDNo:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或与所述SEQIDNo:1所限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白质；或所述SEQIDNo:1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生蛋白。一种重组抑菌蛋白rAmaAAP在制备防控辣椒疫霉病药物中的应用，所述重组蛋白rAmaAAP抑制辣椒疫霉菌。一种重组抑菌蛋白rAmaAAP在制备防控水稻纹枯病药物中的应用，所述重组蛋白rAmaAAP抑制水稻纹枯病菌。一种重组抑菌蛋白rAmaAAP的制备方法，包括以下步骤：步骤1，对SEQIDNo:2所示的核苷酸序列两端添加EcoRI/NotI酶切位点和His标签序列后，进行全基因合成，得到基因片段；步骤2，用EcoRI/NotI双酶切载体pPIC9K和步骤1所得的基因片段，回收纯化，将双酶切后的基因片段与载体pPIC9K连接，得连接产物并将其转化入大肠杆菌XL10感受态中，挑取阳性克隆进行PCR，提取重组质粒，测序，得含有AmaAAP基因的重组质粒，即重组表达载体；步骤3，将所得到的重组表达载体经SalI线性化电转化至毕赤酵母GS115感受态中，挑选含有重组质粒的酵母菌株，以pPIC9K载体通用引物进行PCR扩增，挑选含有重组质粒的酵母菌单菌落；步骤4，将步骤3所述的含有重组质粒的酵母菌株，于0.5％的甲醇，25～30℃，48～96h的诱导条件下，制备得到上清表达的重组蛋白rAmaAAP；步骤5，将步骤4的上清沉淀，纯化后，得到重组蛋白rAmaAAP。本专利技术与现有技术相比而言，具有以下有益效果：1)本专利技术提供一种制备苋菜重组抑菌蛋白rAmaAAP的方法以及利用该方法制备的蛋白对辣椒疫霉和水稻纹枯病菌的抑菌活性，填补了植物源抗菌肽在防治这两种病害中的空白。2)本专利技术合成了苋菜抑菌蛋白AmaAAP适合毕赤酵母表达的核苷酸序列；而且为了保证外源基因的可溶性表达，切除了AmaAAP蛋白的信号肽区域，得到了适合外源表达的缺失型苋菜核糖体失活蛋白的氨基酸序列；建立了AmaAAP蛋白的毕赤酵母表达载体，能快速稳定的获得rAmaAAP蛋白。3)本专利技术提供的rAmaAAP对辣椒疫霉和水稻纹枯病菌具有明显的抑菌效果。4)本专利技术提供的苋菜抑菌重组蛋白rAmaAAP可作为大规模生产的植物源抑菌剂，能减少化学杀菌剂的危害，对病害的生物防治和作物安全具有积极意义。5)本专利技术在全基因合成过程中加入了HIS标签蛋白，具有分子量小，带点少，免疫原性差的特点，并能特异性的结合镍离子，为后续的WB验证和蛋白纯化提供条件。利用毕赤酵母生产重组蛋白，具有分泌型表达的优势，易于工业化生产以及为设计生物农药的剂型提供更多选择。6)本专利技术构建了真核表达载体pPIC9K-AmaAAP，转化毕赤酵母GS115后成功诱导表达了分子量约为35KD的蛋白，该蛋白主要在胞外表达。经镍琼脂糖亲和层析法纯化的蛋白经SDS-PAGE鉴定，纯化的重组蛋白rAmaAAP纯度高。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。图1是真核表达载体构建图，其中，M:DNALadder；1:未线性化pPIC9K；2:构建的载体pPIC9K-AmaAAP线性化后；图2是本专利技术的AmaAAP蛋白表达；图3是本专利技术纯化后的AmaAAP蛋白；图4是本专利技术实施例10的rAmaAAP蛋白对辣椒疫霉菌的抑制作用；图5是本专利技术实施例11的rAmaAAP蛋白对水稻纹枯菌的抑制作用。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效。本专利技术中未详细说明的结构或工作原理属于现有技术和本领域的公知常识，本
的技术人员应当知晓。实施例1本实施例提供一种苋菜抑菌蛋白AmaAAP：对苋菜抑菌蛋白UniprotID：Q96322(基因名AAP，GeneID:AAB67746.1)氨基酸序列进行跨膜区分析，信号肽分析和疏水性分析，得到该基因编码284个氨基酸，6-26aa为跨膜区，1-31aa为信号肽序列，局部亲水性好，预计表达蛋白可溶，选取32-284aa进行毕赤酵母表达。32-284位氨基酸序列即为SEQIDNO:1所示氨基酸序列，命名为苋菜抑菌蛋白AmaAAP。实施例2本实施例提供一种编码上述的苋菜抑菌蛋白AmaAAP的基因：对SEQIDNO:1所示氨基酸序列按毕赤酵母菌密码子偏好性进行密码子优化，优化后的核苷酸序列为SEQIDNo:2，命名为苋菜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苋菜抑菌蛋白AmaAAP，其特征在于，所述苋菜抑菌蛋白AmaAAP的氨基酸序列为SEQ ID No:1。/n

【技术特征摘要】
1.一种苋菜抑菌蛋白AmaAAP，其特征在于，所述苋菜抑菌蛋白AmaAAP的氨基酸序列为SEQIDNo:1。


2.编码权利要求1所述的一种苋菜抑菌蛋白AmaAAP的基因，其特征在于，所述苋菜抑菌蛋白AmaAAP基因的核苷酸序列为SEQIDNo:2。


3.一种含有如权利要求2所述基因的表达载体。


4.一种基于权利要求1所述苋菜抑菌蛋白AmaAAP的重组抑菌蛋白rAmaAAP，其特征在于，所述重组抑菌蛋白rAmaAAP为：
由所述SEQIDNo:1所示的氨基酸序列组成的蛋白；
或与所述SEQIDNo:1所限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白；
或所述SEQIDNo:1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生蛋白。


5.一种如权利要求4所述的重组抑菌蛋白rAmaAAP在制备防控辣椒疫霉病药物中的应用，其特征在于，所述重组蛋白rAmaAAP抑制辣椒疫霉菌。


6.一种如权利要求4所述的重组抑菌蛋白rAmaAAP在制备防控水稻...

【专利技术属性】
技术研发人员：高杜娟，廖石榴，廖晓兰，张亚，
申请(专利权)人：湖南农业大学，湖南省水稻研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43