中性脲酶固定化及其在降解黄酒尿素中的应用制造技术

本发明专利技术提供了中性脲酶固定化及其在降解黄酒尿素中的应用，属于发酵工程技术领域。本发明专利技术以安全无毒的壳聚糖和氧化海藻酸钠分别作为载体和交联剂，采用共价结合法对植物来源的中性脲酶进行固定化，使获得的固定化中性脲酶耐酸性有显著提高。将此固定化中性脲酶处理黄酒，分批处理可有效减除黄酒中约98％的尿素。该方法使对黄酒中尿素的降解基本没有作用的中性脲酶，成为可替代酸性脲酶，可作为用于黄酒中尿素降解的酶制剂。且固定化酶便于回收，可重复利用，在黄酒中基本没有残留。可以安全有效地降低黄酒尿素的含量，从而控制黄酒中氨基甲酸乙酯的含量，为保障黄酒的安全性提供了新的途径。

【技术实现步骤摘要】
中性脲酶固定化及其在降解黄酒尿素中的应用
本专利技术中性脲酶固定化及其在降解黄酒尿素中的应用，属于发酵工程

技术介绍
氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate或Urethane，简称EC)，是一种具有遗传毒性及较强致癌性的物质，天然存在于多种发酵食品(如酱油、食醋、泡菜)和酒精饮料(如黄酒、白酒、葡萄酒、日本清酒、白兰地)中。2007年国际癌症研究机构IARC(theInternationalAgencyforResearchonCancer)将EC归类为2A类致癌物。在酒精饮料中，我国传统黄酒中的EC含量相对较高，这不仅限制了我国黄酒的出口，同时也引起人们对其长期饮用所存在的安全方面的担忧。研究发现，黄酒中的尿素是EC的主要前体物质，90％左右的EC是由尿素和乙醇经化学反应生成的，因此控制黄酒中的尿素含量对于控制EC的生成具有重要意义。关于黄酒中尿素的控制，目前已有一些方法报道，其中利用脲酶是较为直接、简便的方法。但是由于黄酒的酸性环境(pH4.0左右)，国内外大部分研究者主要对酸性脲酶研究较多。虽然酸性脲酶对黄酒中尿素的降解有一定的效果，但酸性脲酶目前只有日本和美国的少数企业实现工业化生产，其进口和使用的安全性问题在国内都有一定的限制。而国内对酸性脲酶的研究还停留在实验研究阶段，尚无商业化酸性脲酶供应，这就大大限制了酸性脲酶处理黄酒的工业化应用。目前有实审阶段申请专利“食品级脲酶、制备方法及其在黄酒中的应用”(专利号201810670334.8)公开了脲酶在黄酒中的应用，但该专利并未公开食品级脲酶的来源和性质以及在是否真的能够应用于黄酒中。我国目前市售的商品脲酶，基本上是植物来源的中性脲酶，其价格便宜，来源广泛。但该酶在在酸性条件下酶活很低，一般认为这种中性脲酶不适合用于黄酒中尿素的降解。近几年国内外对脲酶的固定化研究表明，固定化可以提高脲酶的稳定性和利用效率，但关于中性脲酶的研究很少。有报道利用固定化中性脲酶处理黄酒，需将黄酒pH调至4.8以降低其中的尿素含量。但中性脲酶固定化后是否可以在不改变黄酒特性的条件下用于黄酒中尿素的降解，目前鲜有相关研究报道。综上，目前尚没有文献或专利公开利用安全可靠的固定化中性脲酶直接用于黄酒中降解尿素的方法。
技术实现思路
技术问题：降低黄酒中的尿素含量是控制黄酒中危害物EC的有效手段。但是目前通过脲酶酶法降解黄酒尿素存在诸多限制。活性较高的酸性脲酶国内尚处于研发阶段，尚未实现商品化生产，而商品酸性脲酶主要由国外公司生产，进口及在食品行业应用都收到限制。植物来源的中性脲酶国内虽有生产，但不适用于黄酒的酸性体系，无法有效降解黄酒中的尿素。如何基于国内现有条件，开发可用于黄酒中尿素降解的脲酶制剂，并进行黄酒尿素的有效控制，目前没有切实而可行的方法。技术方案：为了解决上述问题，本专利技术提供了一种利用固定化中性脲酶降解黄酒中尿素的方法，本专利技术使用植物来源的国产中性脲酶，通过安全无毒的固定化材料和方法制备固定化酶，用于黄酒的尿素降解。该方法可有效地降解黄酒中的尿素，尿素降解率最高可达98％。而且该酶制剂及方法安全无毒，可满足食品行业的要求，为黄酒行业EC的控制提供一条切实可行的途径。本专利技术提供的利用固定化中性脲酶降解黄酒中尿素的方法，是利用刀豆等植物来源的中性脲酶，以安全无毒的壳聚糖和氧化海藻酸钠分别作为载体和交联剂，采用共价结合法进行中性脲酶的固定化。在不改变黄酒基本特性的条件下，应用获得的固定化中性脲酶分批或连续处理黄酒，有效减除黄酒中的尿素。本专利技术提供了一种降解黄酒中尿素的方法，利用固定化中性脲酶对黄酒进行处理，所述固定化中性脲酶是以壳聚糖作为载体，氧化海藻酸钠作为交联剂制备得到；所述中性脲酶来源于包括豆类植物和棉籽植物。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法可以采用单次处理或重复利用的方式：(1)单次处理：将制得的固定化中性脲酶按250-1000U/L的加酶量加入黄酒中，在25-30℃，150-200r/min震荡处理黄酒，处理4-24h。(2)重复利用：将单次处理后的黄酒过滤，回收得到的固定化中性脲酶，用于下一批次的黄酒处理，处理条件同步骤(1)，处理10-12h。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还可以是利用固定化的脲酶连续处理黄酒，所述方法为：将制得的固定化酶装入适当容积的层析柱中，室温下将黄酒流经层析柱；调节黄酒样流速约1-2柱体积/h。在本专利技术的一种实施方式中，所述固定化中性脲酶的制备方法为：(1)壳聚糖载体的制备：称取壳聚糖2.5-3.5g，溶于100mL2％的乙酸中，搅拌均匀后，静置1h脱气；凝结液的制作：10％的NaOH与20％的无水乙醇混合制得；用注射器将壳聚糖溶液滴入凝结液中形成微球，凝结一段时间后用去离子水洗涤微球至中性，滤干；(2)脲酶的固定化：称取一定量壳聚糖微球，与无毒性的氧化海藻酸钠溶液进行交联，其中微球质量：交联剂体积比(g/mL)为1：2，在200r/min的震荡交联1-5h，洗涤除去残留的交联剂溶液；交联后的微球与0.1-0.2mg/mL的酶液在4℃下静置6-10h进行固定化；洗涤微球至表面无游离酶，所得固定化酶贮存在4℃备用。本专利技术提供一种提高中性脲酶对酸性条件耐受性的方法，将2.5-3.5％的壳聚糖与海藻酸钠溶液进行交联处理，得到交联后的微球，将交联后的微球与中性脲酶酶液进行固定化处理；所述酸性条件的pH为3.5-4.0。在本专利技术的一种实施方式中，所述中性脲酶来源于大豆、刀豆、豌豆等豆类植物和棉籽等植物。在本专利技术的一种实施方式中，海藻酸钠溶液的浓度为0.02％-0.1％，中性脲酶酶液的浓度为0.1-0.2mg/mL交联处理的时间为1-5小时，固定化处理的时间为4-10小时。本专利技术提供一种提高中性脲酶活力的方法，利用制备得到的固定化中性脲酶对黄酒进行处理。在本专利技术的一种实施方式中，所述固定化中性脲酶的制备方法为：(1)壳聚糖载体的制备：称取壳聚糖2.5-3.5g，溶于100mL2％的乙酸中，搅拌均匀后，静置1h脱气；凝结液的制作：10％的NaOH与20％的无水乙醇混合制得；用注射器将壳聚糖溶液滴入凝结液中形成微球，凝结一段时间后用去离子水洗涤微球至中性，滤干；(2)脲酶的固定化：称取一定量壳聚糖微球，与无毒性的氧化海藻酸钠溶液进行交联，其中微球质量：交联剂体积比(g/mL)为1：2，在200r/min的震荡交联1-5h，洗涤除去残留的交联剂溶液；交联后的微球与0.1-0.2mg/mL的酶液在4℃下静置6-10h进行固定化；洗涤微球至表面无游离酶，所得固定化酶贮存在4℃备用。本专利技术还保护所述制备固定化中性脲酶的方法制备得到的固定化脲酶在降解黄酒尿素中的应用。本专利技术还保护所述提高中性脲酶对酸性条件耐受性的方法，或降解黄酒中尿素的方法在降解黄酒尿素中的应用。有益效果：本专利技术以安全无毒的壳聚糖和氧化海藻酸钠分别作为载体和交联剂，采用共价结合法对植物来源的中性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降解黄酒中尿素的方法，其特征在于，利用固定化中性脲酶对黄酒进行处理，所述固定化中性脲酶是以壳聚糖作为载体，氧化海藻酸钠作为交联剂制备得到；所述中性脲酶来源于包括豆类植物和棉籽植物。/n

【技术特征摘要】
1.一种降解黄酒中尿素的方法，其特征在于，利用固定化中性脲酶对黄酒进行处理，所述固定化中性脲酶是以壳聚糖作为载体，氧化海藻酸钠作为交联剂制备得到；所述中性脲酶来源于包括豆类植物和棉籽植物。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为单次处理，将制得的固定化中性脲酶按250-1000U/L的加酶量加入黄酒中，对黄酒处理4-24h。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是将固定化中性脲酶重复利用，用于处理黄酒，即将制得的固定化中性脲酶按250-1000U/L的加酶量加入黄酒中，处理4-24h，将处理后的黄酒进行过滤，回收得到的固定化中性脲酶，用于下一批次的黄酒处理，处理10-12h。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在25-30℃、150-200r/min下处理黄酒。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是利用固定化中性脲酶连续处理黄酒：将制得的固定化酶装入层析柱中，室温下将黄酒流经层析柱；调节黄酒样流速约1-2柱体积/h。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固...

【专利技术属性】
技术研发人员：王栋，徐岩，李童，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32