青霉素G酰基转移酶高量产菌株选育及发酵方法技术

本发明专利技术属于生物发酵领域，具体涉及一种青霉素G酰基转移酶高产菌株选育及发酵方法。所述方法包括如下步骤：将青霉素G酰基转移酶产生菌用灭菌水进行梯度稀释，培养基上恒温培养过夜；将符合菌落形态标准的菌落接种于摇瓶培养基中恒温培养；将符合菌丝形态和OD

【技术实现步骤摘要】
青霉素G酰基转移酶高量产菌株选育及发酵方法
本专利技术属于生物发酵领域，具体涉及一种青霉素G酰基转移酶高产菌株及该菌株的选育及利用其发酵生产青霉素G酰基转移酶的方法。
技术介绍
青霉素G酰基转移酶是应用于酶法阿莫西林生产中的关键酶，其以6-APA和D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐为基本原来，经缩合反应生成阿莫西林，从而获得β-内酰胺抗生素。国内外文献表明，天然菌株的青霉素G酰基转移酶的酶活性普遍偏低，几乎没有工业应用价值，目前报道的各类天然的菌株最高活力在40U/mL，仍有很大的提升空间。青霉素G酰基转移酶在医药中间体的生产、多肽的合成中，都发挥了关键作用，具有广泛的市场需求和发展前景，是工业上非常重要的生物催化剂，是一种重要的医药工业用酶。生物酶具有反应专一性、高效性和温和性等特点，在化工医药、轻工食品、环境保护等领域发挥着巨大作用，已经成为工业生产的主力军。菌种性能的提高主要通过人工诱导和自然选育，随着基因工程的发展，科研工作者已将工作重点集中在构建基因工程菌以提高青霉素G酰基转移酶的表达活性。在1987年科学界报道了青霉素G酰基转移酶全基因序列，包括信号肽、α亚基、连接肽和β亚基序列，科学家将该酶基因序列，利用DNA重组技术将编码青霉素G酰基转移酶的基因转移到合适的宿主菌中构建高产和分泌型产生菌，可以弥补原产生菌的生产缺陷。若同时采用高密度培养技术，还可以提高分泌产物青霉素G酰基转移酶的生产率和酶活力。目前工业生产青霉素G酰基转移酶工程菌大都为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，二者均已经获得了美国食品药物管理局(FDA)的资格认定。其中大肠杆菌表达系统不能直接将目的蛋白分泌到胞外，后期破胞，提取、纯化工艺较为繁琐。而传统的枯草芽孢杆菌表达系统表达青霉素G酰基转移酶时需要苯乙酸诱导或变温诱导，这增加了发酵过程的控制难度和风险。黄鹤等在《重组青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化》中报道了构建分泌表达青霉素G酰基转移酶的基因工程枯草芽孢杆菌菌株，表达量由3-6u/ml提高到35-40u/ml。杨昇等在《ExpressionandPurificationofExtracellularPenicillinGAcylaseinBacillussubtilis》中报道了利用枯草芽孢杆菌表达系统表达了基因来源为巨大芽孢杆菌的青霉素G酰化酶，优化条件后酶活力达到了40u/ml。2012年发表的响应面法优化重组枯草芽孢杆菌发酵生产青霉素G酰化酶(《浙江理工大学学报》，第29卷，第6期，2012年11月)中报道了利用枯草芽孢杆菌作为产生菌，克服了现有技术的缺点，按照最佳优化培养条件对该菌种进行15L发酵罐扩大培养，并研究了流加补料对产酶的影响，最终确定在对数增长期进行流加补充培养基与水的发酵工艺，发酵40h发酵液中青霉素G酰基转移酶的酶活达到60u/ml。随着酶提取和纯化技术的发展，技术更为先进的大肠杆菌表达系统开始逐渐取代传统枯草芽孢杆菌系统，大肠杆菌表达系统是目前工业化生产中最常用的细菌表达系统之一，根据相关报道记载，行业内青霉素G酰基转移酶的酶活普遍在80-100u/ml左右。由于基因工程菌的广泛应用，经过基因技术改良的原始菌种已经广泛应用到国内青霉素G酰基转移酶产业，目前国内菌种性能及发酵水平的差异主要表现在经过人工选育的产生菌菌体性能的比较。因此，通过对现有基因工程菌进行选育和筛选，对比各形态菌株的性能，从而获得生长健壮、性能优良、更适用于生产的高产菌株，并根据菌种的特性，确定最适宜的培养条件和发酵工艺参数，从而提高青霉素G酰基转移酶的发酵水平，提高发酵单位成为目前研究的重点。
技术实现思路
针对以上技术情况，本专利技术提供了一种提高青霉素G酰基转移酶产量的菌种选育及发酵的方法，本专利技术方法可以提高青霉素G酰基转移酶发酵单位、提高生产率、降低生产成本。本专利技术所述提高青霉素G酰基转移酶产量的选育及发酵的方法包括如下步骤：(1)青霉素G酰基转移酶产生菌用灭菌水进行梯度稀释，得到稀释液；(2)将步骤(1)中所述稀释液于培养基上恒温培养过夜；(3)将步骤(2)中符合菌落形态标准的菌落，接种于摇瓶培养基中恒温培养；(4)将步骤(3)中符合菌丝形态和OD600值标准的摇瓶，并低温保存；(5)将步骤(4)中的菌丝接种于种子瓶培养基中恒温培养，控制种子瓶OD600值标准，然后再次接入种子瓶培养基中，相同条件下进行扩大培养；(6)制备发酵罐培养基，并配制补料瓶溶液，进行发酵扩大培养，适时补充料瓶溶液，并补入诱导剂。本专利技术方法中的所述青霉素G酰基转移酶产生菌菌种可以为任何来源，包括但不限于自我突变、诱导突变或市售等等。本专利技术方法中所述梯度稀释没有特别限制，本专利技术包括但不限于梯度稀释为从10-1到10-9。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(2)中，所述培养基为：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％、琼脂粉1.5％、PH值7.2-7.3。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(3)中摇瓶培养基或(5)中种子瓶培养基为：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％、PH值7.2-7.3。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(6)中，所述补料瓶溶液为：50％甘油。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(6)中，所述诱导剂为IPTG溶液。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(6)中，所述发酵罐培养基为：酵母浸膏5-20g/L、蛋白胨10-25g/L、硫酸铵2-8g/L、磷酸氢二钾5-15g/L、磷酸二氢钾2-8g/L、硫酸镁0.2-1.5g/L、甘油3-10g/L、葡萄糖0.1-1.0g/L、消沫剂0.01-0.06g/L、pH值7-8。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(3)中，所述菌落形态符合标准的菌落为：颜色均匀单一，最优为白色；菌落直径为1-2mm，单菌落最优为凸起状。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(4)中，所述菌丝形态和OD600值符合标准的摇瓶，其中所述菌丝形态为菌丝长短、粗细均匀，以细长菌丝为主。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(4)中低温保存时保存的温度为-70℃以下。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(4)或(5)中所述OD600值为0.6-0.8。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(2)(3)或(5)中，所述恒温培养的温度为28℃。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(6)中进一步包括：所述发酵的温度为28℃，pH值为7.0，罐压为0.05Mpa，初始空气流量为8L/min，转速为150rpm。本专利技术方法中，作为实施方案之一，步骤(6)中进一步包括：发酵的温度为28℃，pH值为7.0，罐压为0.05Mpa，初始空气流量为8L/min，转速为150rpm；发酵过程中保持制DO值为30-50％。本专利技术中作为示例性的说明，例如当DO值下降时，通过调节空气流量和转速，维持DO值不低于45％，转速最高500rpm，待DO值反弹时，开始本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高青霉素G酰基转移酶菌株产量的菌种选育及发酵的方法，所述方法包括如下步骤：/n(1)青霉素G酰基转移酶产生菌用灭菌水进行梯度稀释，得到稀释液；/n(2)将步骤(1)中所述稀释液于培养基上恒温培养过夜；/n(3)将步骤(2)中符合菌落形态标准的菌落，接种于摇瓶培养基中恒温培养；/n(4)将步骤(3)中符合菌丝形态和OD

【技术特征摘要】
1.一种提高青霉素G酰基转移酶菌株产量的菌种选育及发酵的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)青霉素G酰基转移酶产生菌用灭菌水进行梯度稀释，得到稀释液；
(2)将步骤(1)中所述稀释液于培养基上恒温培养过夜；
(3)将步骤(2)中符合菌落形态标准的菌落，接种于摇瓶培养基中恒温培养；
(4)将步骤(3)中符合菌丝形态和OD600值标准的摇瓶，低温保存；
(5)将步骤(4)中的菌丝接种于种子瓶培养基中恒温培养，控制种子瓶OD600值标准，然后再次接入种子瓶培养基中，相同条件下进行扩大培养；
(6)制备发酵罐培养基，并配制补料瓶溶液，进行发酵扩大培养适时补充料瓶溶液，并补入诱导剂。


2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养基为：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％、琼脂粉1.5％，PH值7.2～7.3。


3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中摇瓶培养基或步骤(5)中种子瓶培养基为：酵母浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠1％、PH值7.2-7.3。


4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(6)中，所述补料瓶溶液为：50％甘油。


5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(6)中，所述诱导剂为IPTG。


6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(6)中，所述发酵罐培养基为：酵母浸膏5-20g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄勤，廖挺，强生平，田喜珍，
申请(专利权)人：联邦制药内蒙古有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15