青霉素G酰化酶突变体及其在酶法合成头孢孟多中的应用制造技术

本发明专利技术涉及青霉素G酰化酶突变体及其在酶法合成头孢孟多中的应用。通过半理性设计的酶工程改造技术对木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)PX02来源的青霉素G酰化酶进行突变，获得了一种反应活性更高，反应速率更快，转化率更好的PGA突变体。该PGA突变体对产物的水解活性大大降低，在产率达到最大值后，几乎不水解产物，具有广阔的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
青霉素G酰化酶突变体及其在酶法合成头孢孟多中的应用
本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种木糖氧化无色杆菌来源青霉素G酰化酶突变体及在酶法合成头孢孟多中的应用。
技术介绍
β-内酰胺类抗生素如头孢孟多属第二代头孢菌素高效医用药，杀菌力强，抗菌谱广其作用机制是通过抑制细菌的乙酰转肽酶而干扰细胞壁肽聚糖的合成，使细菌变成丝状或球状，最后溶解，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有很强的杀灭作用。临床上主要用于治疗敏感细菌所致的呼吸道感染、胆道感染、腹腔感染、盆腔感染、尿路感染、皮肤软组织感染、骨和关节感染以及败血症等。目前，国内企业已用化学法实现了大多数头孢类原料药的国产化，但酶法生产半合成头孢类抗生素尚未大规模产业化。与传统的化学法合成相比，酶法合成β-内酰胺类抗生素具有反应步骤少，废弃物产生少，有利于环境保护，生产成本降低，产品杂质少、易分离且质量优异等诸多优点。因此，β-内酰胺抗生素的酶法合成是21世纪β-内酰胺抗生素发展的趋势之一。青霉素G酰化酶(penicillinGacylase，EC3.5.1.11)又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶，是一种N末端亲核丝氨酸水解酶。大部分酶具有水解特性已广泛应用于天然青霉素G的水解来获得β-内酰胺抗生素母核，然而只有少部分酶具有良好的酰化特性能够应用在β-内酰胺抗生素的合成中。青霉素G酰化酶主要应用于抗生素工业中β-内酰胺抗生素中间体6-APA(6-氨基青霉烷酸)的生产和半合成β-内酰胺抗生素的合成。此外，它作为一种生物催化剂，还有其他许多潜在的应用，比如手性拆分、手性肽的合成、酯类化合物的水解等。因此，青霉素G酰化酶是工业上应用价值很高的酶。在酶法制备半合成β-内酰胺类抗生素中，其主要在动力学控制下进行合成反应。在反应中必须提供活化的酰基供体，在合成体系中主要存在以下三个反应：(1)β-内酰胺抗生素产物的生成；(2)活化酰基供体的水解反应；(3)合成的抗生素的水解反应。最终转化率取决于这三个反应之间的平衡。SriranganK等(Biotechnologyadvances，2013，31(8):1319-1332)分析了青霉素酰化酶的水解机理可知，在青霉素G先脱掉6-APA后，苯乙酰基-酶中间体会受到H2O分子的亲核进攻，形成苯乙酸。由于整个过程是可逆的，所以在偏酸性低温条件下，可以用青霉素G酰化酶催化酰基供体R-MMA(扁桃酸甲酯)和β-内酰胺母核7-TMCA一步催化合成头孢孟多。Terreni等(ApplMicrobiolBiotechnol，2007，77:579–587)固定化大肠杆菌(Escherichiacoli)来源的青霉素G酰化酶，在母核7-TMCA浓度50mM，底物摩尔比R-MMA/7-TMCA＝3:1，pH6.5，4℃的条件下催化合成头孢孟多，转化率71-76％。IlonaEstruch等(EnzymeandMicrobialTechnology，2008，42：121–129)固定化大肠杆菌(Escherichiacoli)来源的青霉素G酰化酶，在母核7-TMCA浓度50mM，底物摩尔比R-MMA/7-TMCA＝3:1，pH6.5，4℃的条件下催化合成头孢孟多，转化率77％，合成水解比1.5。国内外对生物催化研究越来越多，其中一个关键问题就是所用的酶往往不能满足实际工业化生产的需求。如本申请涉及的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的野生型青霉素G酰化酶，虽然其能够催化缩合7-TMCA与扁桃酸甲酯合成头孢孟多，但是合成水解比较低，生成的副产物较多，从而转化率只有40％左右。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种高合成活性青霉素G酰化酶突变体。为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种青霉素G酰化酶突变体，将SEQIDNO：2所示青霉素G酰化酶氨基酸序列的第186位、187位、329位氨基酸残基中的一个或多个突变为另一种氨基酸残基，获取所述突变体。所述突变体可以是单点突变、两点组合突变或三点组合突变。所述SEQIDNO：2所示的野生青霉素G酰化酶来源于木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)PX02。该菌株已在申请人在先专利CN106399174A中公开，保藏号CCTCCNO:M2016392。进一步的，所述第186位精氨酸突变为丙氨酸、天冬氨酸或赖氨酸，优选丙氨酸。第187位苯丙氨酸突变为异亮氨酸或缬氨酸，优选异亮氨酸。第329位苯丙氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或丝氨酸；优选甘氨酸。其中，优选的突变体为R186A/F187I、R186A/F329G、F187I/F329G或R186A/F187I/F329G；最优选R186A/F187I/F329G。本专利技术的第二个目的是提供上述的突变型青霉素G酰化酶的制备方法，包括以下步骤：a)将木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)PX02野生型青霉素G酰化酶核苷酸序列(SEQIDNO：1)进行饱和突变、迭代饱和突变等步骤得到上述任一种青霉素G酰化酶的突变体的基因序列；b)将突变体基因序列插入到质粒中得到表达载体；c)将表达载体转化进入菌株中得到重组基因工程菌；d)将重组基因工程菌用IPTG诱导进行发酵得到青霉素G酰化酶。本专利技术涉及的突变型青霉素G酰化酶的制备方法，将产青霉素G酰化酶重组菌破碎、离心、收集获得酶液。本专利技术的第三个目的是应用上述的突变型青霉素G酰化酶制备头孢孟多，并对催化条件进行优化，包括：反应底物头孢甲肟中间体7-TMCA(7-氨基-3-(1-甲基-1H-四唑-5-硫代甲基)-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸)和侧链R-扁桃酸甲酯R-MMA浓度范围10mM-100mM；R-MMA与7-TMAC的摩尔比为1～1.5:1；优选1.3:1。进一步的，反应体系中添加甘油；甘油添加浓度为0～50％(V/V)，优选30％(V/V)。进一步的，反应体温温度为5～30℃，优选20℃。进一步的，反应体系初始pH为5.8～6.6℃，优选6.0。本专利技术通过饱和突变、迭代饱和突变等半理性设计的酶工程改造技术对木糖氧化无色杆菌(AchromobacterxylosoxidansPX02)来源的PGA进行突变，提供了多种新的青霉素G酰化酶突变体(包括单点突变，两点组合突变和三点组合突变)，相对野生酶提高了合成水解比，且缩短了反应时间。此外，本专利技术对催化条件进行优化，在最优条件下，三点组合突变体R186A/F187I/F329G在催化合成反应中使头孢孟多转化率从40％提高至85％以上，合成水解比从1.12提高至4.6。最重要的是对产物的水解活性大大降低，在产率达到最大值后，几乎不水解产物，具有广阔的工业应用前景。附图说明图1为实施例3的反应原理图。图2为甘油添加量对酶法合成头孢孟多的影响。图3为温度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，将SEQ ID NO：2所示青霉素G酰化酶氨基酸序列的第186位、187位、329位氨基酸残基中的一个或多个突变为另一种氨基酸残基，获取所述突变体。/n

【技术特征摘要】
1.一种青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，将SEQIDNO：2所示青霉素G酰化酶氨基酸序列的第186位、187位、329位氨基酸残基中的一个或多个突变为另一种氨基酸残基，获取所述突变体。


2.根据权利要求1所述的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述第186位精氨酸突变为丙氨酸、天冬氨酸或赖氨酸，优选丙氨酸。


3.根据权利要求1所述的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述第187位苯丙氨酸突变为异亮氨酸或缬氨酸，优选异亮氨酸。


4.根据权利要求1所述的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述第329位苯丙氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或丝氨酸；优选甘氨酸。


5.根据权利要求1所述的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体为R186A/F187I、R186A/F329G、...

【专利技术属性】
技术研发人员：何冰芳，李安妮，储建林，吴斌，汲晓琪，彭智熠，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32