非天然碱基对组合物及使用方法技术

本文公开了用于增加包含一种或多种非天然氨基酸的多肽的产生的方法、细胞、工程化微生物和试剂盒。还提供了用于增加编码所述非天然氨基酸的非天然核酸在工程化细胞或半合成生物体中的保留的细胞、工程化微生物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】非天然碱基对组合物及使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年12月29日提交的美国临时专利申请号62/612,062的权益，其通过引用以其整体并入本文。关于联邦赞助研究的声明本文公开的本专利技术至少部分是在美国国立卫生研究院(NIH)的授权号R35GM118178/GM/NIGMS下在美国政府的支持下完成的。因此，美国政府对本专利技术拥有一定的权利。序列表本申请含有以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。2018年12月20日创建的所述ASCII副本命名为46085-712_601_SL.txt并且大小为116,287字节。
技术介绍
用聚合酶以序列特异性方式合成/扩增寡核苷酸(DNA或RNA)的能力的应用受限于天然遗传字母(DNA中的四个天然核苷酸A、C、G和T以及RNA中的四个天然核苷酸A、C、G和U)中存在的有限的化学/物理多样性。包括非天然核酸的扩展的遗传字母增加了细胞中可以储存的信息并且促进产生使用该增加的信息产生新型形式的基因表达产物的半合成生物体(SSO)。
技术实现思路
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【技术保护点】
1.一种工程化宿主细胞，所述工程化宿主细胞包含：/na.包含非天然核苷酸的第一核酸分子；以及/nb.任选地，编码修饰的转座相关蛋白或可转座元件的第二核酸分子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171229 US 62/612,0621.一种工程化宿主细胞，所述工程化宿主细胞包含：
a.包含非天然核苷酸的第一核酸分子；以及
b.任选地，编码修饰的转座相关蛋白或可转座元件的第二核酸分子。


2.根据权利要求1所述的工程化宿主细胞，其还包含：
a.编码修饰的核苷三磷酸转运蛋白的第三核酸分子，其中所述第三核酸分子被掺入所述工程化宿主细胞的基因组序列中，或者包含编码所述修饰的核苷三磷酸转运蛋白的质粒。


3.根据权利要求1所述的工程化宿主细胞，其中如与在不包含编码所述修饰的转座相关蛋白的所述第二核酸分子的等同工程化宿主细胞中的表达相比，所述修饰的核苷三磷酸转运蛋白在所述工程化宿主细胞中展现增加的表达稳定性。


4.根据权利要求2所述的工程化宿主细胞，其中所述修饰的核苷三磷酸转运蛋白包含编码所述核苷三磷酸转运蛋白的整个核酸分子的缺失、N末端截短、C末端截短或两个末端的截短。


5.根据权利要求2所述的工程化宿主细胞，其中修饰的核苷三磷酸转运蛋白包含来自三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的核苷三磷酸转运蛋白(PtNTT2)。


6.根据权利要求5所述的工程化宿主细胞，其中所述PtNTT2在选自pSC质粒的启动子或来自lac操纵子的启动子的控制下。


7.根据权利要求2所述的工程化宿主细胞，其还包含：
a.Cas9多肽或其变体；以及
b.包含crRNA-tracrRNA支架的单一指导RNA(sgRNA)，其中Cas9多肽或其变体与sgRNA的组合调节编码所述非天然核苷酸的所述第一核酸分子的复制。


8.根据权利要求1所述的工程化宿主细胞，其中所述第二核酸分子包含含有过氧化氢酶(cat)、IS1蛋白insB-4(insB-4)、IS1蛋白insA-4(insA-4)或其组合的基因。


9.根据权利要求1所述的工程化宿主细胞，其中所述修饰的转座相关蛋白包含插入元件IS14蛋白InsB、插入元件IS14蛋白InsA或其组合；并且其中所述修饰的可转座元件包含IS1。


10.根据权利要求8所述的工程化宿主细胞，其中所述基因包含一个或多个缺失，其中所述一个或多个缺失包含N末端缺失、C末端缺失、两个末端的截短、内部缺失和/或整个基因的缺失。


11.根据权利要求1所述的工程化宿主细胞，其还包含编码修饰的DNA修复反应相关蛋白的第五核酸分子，其中所述DNA修复反应包括重组修复、SOS反应、核苷酸切除修复或甲基定向的错配修复或其组合。


12.根据权利要求11所述的工程化宿主细胞，其中所述修饰的DNA修复反应相关蛋白包含RecA、Rad51、RadA或LexA或其组合。


13.根据权利要求1所述的工程化宿主细胞，其中所述工程化宿主细胞是原核细胞，包括大肠杆菌细胞、大肠杆菌BL21(DE3)细胞。


14.根据权利要求1所述的工程化宿主细胞，其中所述非天然核苷酸包含选自以下的非天然碱基：2-氨基腺嘌呤-9-基，2-氨基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶，2-硫代胞嘧啶，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和烷基衍生物，2-氨基-腺嘌呤，2-氨基-丙基-腺嘌呤，2-氨基吡啶，2-吡啶酮，2'-脱氧尿苷，2-氨基-2'-脱氧腺苷3-脱氮杂鸟嘌呤，3-脱氮杂腺嘌呤，4-硫代尿嘧啶，4-硫代胸腺嘧啶，尿嘧啶-5-基，次黄嘌呤-9-基(I)，5-甲基-胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，5-溴和5-三氟甲基尿嘧啶和胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶，5-卤代胞嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，5-尿嘧啶，5-取代、5-卤代、5-取代嘧啶，5-羟基胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯胞嘧啶，氯化胞嘧啶，环胞嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷，5-氟胞嘧啶，氟嘧啶，氟尿嘧啶，5,6-二氢胞嘧啶，5-碘胞嘧啶，羟基脲，碘尿嘧啶，5-硝基胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶和5-碘尿嘧啶，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-烷基衍生物，6-氮杂嘧啶，6-偶氮-尿嘧啶，6-偶氮胞嘧啶，氮杂胞嘧啶，6-偶氮-胸腺嘧啶，6-硫鸟嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，7-甲基腺嘌呤，7-脱氮杂鸟嘌呤，7-脱氮杂鸟苷，7-脱氮杂-腺嘌呤，7-脱氮杂-8-氮杂鸟嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤，8-氮杂腺嘌呤，8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基和8-羟基取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；N4-乙基胞嘧啶，N-2取代的嘌呤，N-6取代的嘌呤，O-6取代的嘌呤，增加双链体形成的稳定性的那些，通用核酸，疏水核酸，混杂核酸，尺寸扩展的核酸，氟化核酸，三环嘧啶，吩噁嗪胞苷([5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹，吩噁嗪胞苷(9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)，吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰基胞嘧啶，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖基辫苷，肌苷，N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2,2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖基辫苷，5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5氧乙酸，怀丁氧苷，假尿嘧啶，辫苷，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧杂乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧杂乙酸，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤以及嘌呤或嘧啶碱基被杂环替代的那些。


15.根据权利要求1所述的工程化宿主细胞，其中所述非天然碱基选自：

。


16.根据权利要求1所述的工程化宿主细胞，其中所述非天然核苷酸还包含非天然糖部分。


17.根据权利要求16所述的工程化宿主细胞，其中所述非天然糖部分选自：2'位置的修饰：OH；取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2F；O-烷基、S-烷基、N-烷基；O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基；O-烷基-O-烷基、2'-F、2'-OCH3、2'-O(CH2)2OCH3，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、-O[(CH2)nO]mCH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)n-ONH2和-O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是1至约10；和/或5'位置的修饰：5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)；4'位置的修饰、4'-S、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、改进寡核苷酸的药代动力学特性的基团、或改进寡核苷酸的药效学特性的基团及其任何组合。


18.一种增加包含非天然核苷酸的核酸分子的产生的方法，所述方法包括：
a)将工程化宿主细胞与多种非天然核苷酸一起孵育，其中所述工程化宿主细胞包含修饰的核苷三磷酸转运蛋白以及任选地修饰的转座相关蛋白或可转座元件；以及
b)将所述多种非天然核苷酸掺入一条或多条新合成的DNA链中，由此产生所述非天然核酸分子；
其中所述修饰的转座相关蛋白或可转座元件以及所述修饰的核苷三磷酸转运蛋白增加包含所述非天然核苷酸的非天然碱基对在所述一条或多条新合成的DNA链中的保留。


19.根据权利要求18所述的方法，其中所述修饰的转座相关蛋白包含插入元件IS14蛋白InsB、插入元件IS14蛋白InsA或其组合；并且其中所述修饰的可转座元件包含IS1。


20.根据权利要求18所述的方法，其中所述修饰的核苷三磷酸转运蛋白包含密码子优化的来自三角褐指藻的核苷三磷酸转运蛋白(PtNTT2)。


21.根据权利要求18所述的方法，其中所述非天然核苷酸包含选自以下的非天然碱基：2-氨基腺嘌呤-9-基，2-氨基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶，2-硫代胞嘧啶，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和烷基衍生物，2-氨基-腺嘌呤，2-氨基-丙基-腺嘌呤，2-氨基吡啶，2-吡啶酮，2'-脱氧尿苷，2-氨基-2'-脱氧腺苷3-脱氮杂鸟嘌呤，3-脱氮杂腺嘌呤，4-硫代尿嘧啶，4-硫代胸腺嘧啶，尿嘧啶-5-基，次黄嘌呤-9-基(I)，5-甲基-胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，5-溴和5-三氟甲基尿嘧啶和胞嘧啶；5-卤代...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·E·罗梅斯伯格，M·P·莱德贝特，R·J·卡拉狄玛，
申请(专利权)人：斯克利普斯研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US