【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于DNA、特别是细胞游离DNA的表观遗传学分析的方法
本专利技术总体上涉及生物技术，并且更特别地涉及细胞游离DNA的表观遗传学分析。本专利技术的发现可用于基因组学、医学、诊断学和表观遗传学研究领域。
技术介绍
表观遗传学领域要求检测某些DNA修饰，特别是经修饰的胞嘧啶残基5-甲基胞嘧啶(5mC)及其主要氧化产物5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)：最初，研究人员专注于5mC，因为直到后来5hmC才被鉴定为潜在的重要修饰。为了在单碱基分辨率下区分未经修饰的胞嘧啶残基和5mC残基，DNA表观遗传学分析通常需要使用亚硫酸氢盐试剂，只要亚硫酸氢盐通过方案1的方法迅速将胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基。方案1:然而如方案2所示，在5mC的情况下表现出非常低的转化率。方案2:然而，在单碱基分辨率分辨率测序中使用亚硫酸氢盐有两个严重的缺点。首先，亚硫酸氢盐导致DNA显著降解，高达90％或更高。这妨碍了使用非常少量的DNA来实施该技术，例如在细胞游离DNA的情况下，因为细胞游离DNA每...
【技术保护点】
1.一种用于将细胞游离DNA中的氧化的5-甲基胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基的方法，包括使含有选自5-羧甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶及其组合的至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基的细胞游离DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷有效地使所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱甲酰基，从而提供二氢尿嘧啶残基代替它。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180214 US 62/630,7981.一种用于将细胞游离DNA中的氧化的5-甲基胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基的方法，包括使含有选自5-羧甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶及其组合的至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基的细胞游离DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷有效地使所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱甲酰基，从而提供二氢尿嘧啶残基代替它。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-羧甲基胞嘧啶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-甲酰基胞嘧啶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-羧甲基胞嘧啶和5-甲酰基胞嘧啶的组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述有机硼烷包含硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述氮杂环包含任选经1-4个低级烷基取代的吡啶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述氮杂环包含吡啶、2-甲基吡啶或5-乙基-2-甲基吡啶。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述氮杂环包含2-甲基吡啶，并且所述有机硼烷是2-甲基吡啶硼烷。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述有机硼烷包含硼烷和叔胺的络合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述叔胺选自三乙胺和三(叔丁基)胺。
12.根据权利要求1所述的方法，其中还原、脱氨基和脱羧基在不分离任何中间体的情况下进行。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在不存在亚硫酸氢盐的情况下进行。
14.一种反应混合物，其包含：
(a)含有选自5-羧甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶及其组合的至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基的细胞游离DNA样品；和
(b)有机硼烷，所述有机硼烷有效地使所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱甲酰基。
15.根据权利要求14所述的混合物，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-羧甲基胞嘧啶。
16.根据权利要求14所述的混合物，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-甲酰基胞嘧啶。
17.根据权利要求14所述的混合物，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-羧甲基胞嘧啶和5-甲酰基胞嘧啶的组合。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的混合物，其中所述有机硼烷包含硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物。
19.根据权利要求18所述的混合物，其中所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物。
20.根据权利要求19所述的混合物，其中所述氮杂环包含任选经1-4个低级烷基取代的吡啶。
21.根据权利要求20所述的混合物，其中所述氮杂环包括吡啶、2-甲基吡啶或5-乙基-2-甲基吡啶。
22.根据权利要求21所述的混合物，其中所述氮杂环包含2-甲基吡啶，并且所述有机硼烷是2-甲基吡啶硼烷。
23.根据权利要求18所述的混合物，其中所述有机硼烷包含硼烷和叔胺的络合物。
24.根据权利要求23所述的混合物，其中所述叔胺选自三乙胺和三(叔丁基)胺。
25.根据权利要求14所述的混合物，其中所述混合物基本上不含亚硫酸氢盐。
26.一种用于检测细胞游离DNA中5-甲基胞嘧啶残基的存在和位置的方法，其中所述方法包括：
(a)对片段化的接头连接的细胞游离DNA中的5-羟甲基胞嘧啶残基进行修饰以在其上提供亲和标签，其中所述亲和标签使得能够从所述细胞游离DNA中除去含有经修饰的5-羟甲基胞嘧啶的DNA；
(b)从所述细胞游离DNA中除去所述含有经修饰的5-羟甲基胞嘧啶的DNA，留下含有未经修饰的5-甲基胞嘧啶残基的DNA；
(c)使所述未经修饰的5-甲基胞嘧啶残基氧化，以得到含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA；
(d)使所述含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷有效地使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱甲酰基，从而提供含有二氢尿嘧啶残基代替所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA；
(e)对所述含有二氢尿嘧啶残基的DNA进行扩增和测序；
(f)从(e)的测序结果确定5-甲基化模式。
27.根据权利要求26所述的方法，还包括：
(g)鉴定在步骤(b)中从所述细胞游离DNA样品中除去的所述含有5-羟甲基胞嘧啶的DNA的羟甲基化模式。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中步骤(a)至(d)在不存在亚硫酸氢盐的情况下进行。
29.根据权利要求26或27所述的方法，其中步骤(a)至(d)在不分离任何中间体的情况下进行。
30.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述亲和标签包含生物素，并且步骤(a)包括用生物素选择性标记5-羟甲基胞嘧啶残基。
31.根据权利要求30所述的方法，其中步骤(b)包括使生物素化的DNA与支撑物结合的链霉亲合素接触。
32.根据权利要求26或27所述的方法，其中步骤(c)以酶促方式进行。
33.根据权利要求3...
【专利技术属性】
技术研发人员：PA阿伦斯多夫，D斯帕克，C宋，
申请(专利权)人：蓝星基因组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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