用于DNA、特别是细胞游离DNA的表观遗传学分析的方法技术

提供了用于使用有机硼烷将细胞游离DNA中的氧化的5‑甲基胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶(DHU)残基的细胞游离DNA的表观遗传学分析方法。使细胞游离DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷经选择以成功地引起氧化的5‑甲基胞嘧啶残基(例如5‑羧甲基胞嘧啶和5‑甲酰基胞嘧啶)的还原、脱氨基和脱羧基，从而代替其产生DHU残基。扩增后，对经处理的细胞游离DNA进行测序，DHU残基读取为胸腺嘧啶残基。还提供了反应混合物、试剂盒和另外的方法，以及用于DNA(包括细胞游离DNA)的表观遗传学分析的相关方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于DNA、特别是细胞游离DNA的表观遗传学分析的方法
本专利技术总体上涉及生物技术，并且更特别地涉及细胞游离DNA的表观遗传学分析。本专利技术的发现可用于基因组学、医学、诊断学和表观遗传学研究领域。
技术介绍
表观遗传学领域要求检测某些DNA修饰，特别是经修饰的胞嘧啶残基5-甲基胞嘧啶(5mC)及其主要氧化产物5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)：最初，研究人员专注于5mC，因为直到后来5hmC才被鉴定为潜在的重要修饰。为了在单碱基分辨率下区分未经修饰的胞嘧啶残基和5mC残基，DNA表观遗传学分析通常需要使用亚硫酸氢盐试剂，只要亚硫酸氢盐通过方案1的方法迅速将胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基。方案1:然而如方案2所示，在5mC的情况下表现出非常低的转化率。方案2:然而，在单碱基分辨率分辨率测序中使用亚硫酸氢盐有两个严重的缺点。首先，亚硫酸氢盐导致DNA显著降解，高达90％或更高。这妨碍了使用非常少量的DNA来实施该技术，例如在细胞游离DNA的情况下，因为细胞游离DNA每mL血浆通常仅包含几纳克DNA。第二，亚硫酸氢盐方法假定胞嘧啶完全转化为胸腺嘧啶，使亚硫酸氢盐过程容易出现假阳性，甚至1％的非转化率也导致10％-15％或更高的假阳性读数。依赖于完全转化还导致引物设计困难、测序读取的低定位速率及测序成本的总体增加。随着表观遗传学领域的发展，另一种DNA修饰5hmC的检测被证明潜在地与5mC的检测一样重要。虽然5mC修饰通常发生在CpG二核苷酸内，但是天然5hmC残基倾向于出现在其他位置。此外，根据组织类型，5hMC的发生频率比5mC的发生频率要低得多，比率通常为约10:1(参见Nestor等(2012)GenomeBiology13:R84)，其中5mC代表所有DNA碱基的约1％。尽管已经确定5hmC参与多种过程，包括转录、DNA脱甲基化，和在5hmC模式异常的情况下参与肿瘤发生，但是5hmC的分子功能才开始被了解。参见Tahiliani等(2009)Science324(5929):930-035(2009)；Guo等(2011)Cell145:423-434；Wu等(2011)Genes&Development25:679-684；Ko等(2010)Nature468:839-843；和Robertson等(2011)Biochem.Biophys.Res.Comm.411(1):40-3。还已知5hmC是稳定的DNA修饰，是由5mC通过10-11易位(TET)酶(例如TET1)催化氧化而形成的。亚硫酸氢盐测序不能区分5mC和5hmC，因此，需要用于单独检测5mC和5hmC残基的其他方法。如上所述，5hmC的出现通常远低于5mC，因此，相对于所有经鉴定的5hmC残基的比例以及高选择性，用于检测5hmC的任何方法都需要表现出高效率，意味着基本上所有鉴定为5hmC的残基实际上应该是5hmC残基。已报道了数种用于检测DNA中5hmC的方法，这些方法涉及用T4噬菌体酶、β-葡萄糖基转移酶(β-GT)进行糖基化，因为该酶选择性修饰5hmC而不修饰5mC，如方案3所示：方案3:例如，Robertson等描述了使用J结合蛋白下拉具有糖基化的5hmC残基的靶DNA片段(参见Robertson等(2011)Nuc.AcidsRes.39,e55)。其他人已经提出了使用针对5hmC的抗体区分5mC和5hmC的可能性。最近，例如通过用在6位被叠氮部分官能化的尿苷二磷酸(UDP)葡萄糖进行糖基化，以在那些位置提供叠氮基的方式进行了5hmC残基的选择性糖基化。该5hmC残基的选择性反应在那些位置提供叠氮基，然后用经炔烃官能化的生物素进行自发的1,3-环加成反应，这类反应在本领域中通常被称为“点击化学”。然后可以用链霉亲合素珠将含有这些生物素化的5hmC残基的DNA片段下拉。参见Quake等的国际专利公开号WO2017/176630，其详细描述了这样的方法。还参见He等的美国专利号8,741,567和Lu等的美国专利公开号US2017/0253924，涉及一种通过选择性地使5hmC残基糖基化来区分5mC和5hmC的方法。然而，仍然需要进行单碱基分辨率测序的替代方法，特别是对于极小的样品大小，例如用于细胞游离DNA分析的那些。一种理想的方法是以单碱基分辨率检测经修饰的胞嘧啶残基，而不影响正常的胞嘧啶残基。最优地，该方法可以容易地适用于检测除5mC之外或代替5mC的5hmC，即使对于同时包含5mC和5hmC残基二者的DNA单链。以碱基分辨率分别检测5hmC和5mC的方法可能具有巨大的重要性，因为该过程会使得能够绘制两个表观遗传学标志物。优选使用无毒的试剂和温和的反应条件，以避免或至少使DNA降解最小化。最后，一种理想的方法使得能够用至少一种分子条形码(或“序列条形码”)给DNA片段加标签，该分子条形码是一种短且独特的寡核苷酸序列，在测序过程中，该序列用于鉴定每个包含该序列的DNA链或片段的一个或更多个特征。
技术实现思路
因此，本专利技术通过提供一种用于细胞游离DNA的表观遗传学分析的新方法来解决本领域中的上述需求。在第一实施方案中，提供了一种用于将细胞游离DNA中的氧化的5-甲基胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基的方法，其中所述方法包括使含有选自5-羧甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶及其组合的至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基的细胞游离DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷有效地使所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱甲酰基，从而提供二氢尿嘧啶残基代替它。在前述实施方案的一个方面，所述有机硼烷包含硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物。在实施方案的另一方面，还原、脱氨基和脱羧基在不分离任何中间体的情况下进行，即作为“一锅”或“单管”反应。在实施方案的另一方面，所述方法在不存在任何亚硫酸氢盐试剂的情况下进行。在实施方案的又一方面，细胞游离DNA包含细胞游离DNA的选定区域，其中“区域”是指沿DNA链或基于序列的组合物的位置。在相关方面，除细胞游离DNA的选定区域之外或代替细胞游离DNA的选定区域，细胞游离DNA包含细胞游离DNA的选定片段。在实施方案的另一方面，细胞游离DNA包括双链DNA。在实施方案的另一方面，细胞游离DNA包括单链DNA。在另一个实施方案中，提供了一种反应混合物，其包含：(a)含有选自5-羧甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶及其组合的至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基的细胞游离DNA样品；和(b)有机硼烷，所述有机硼烷有效地使所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱甲酰基。在另一个实施方案中，提供了一种用于检测细胞游离DNA中5-甲基胞嘧啶残基的存在和位置的方法，其中所述方法包括：(a)对片段化的接头连接的细胞游离DNA中的5-羟甲基胞嘧啶残基进行修饰以在其上提供亲和标签，其中所述亲和标签使得能够从所述细胞游离DNA中除去本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于将细胞游离DNA中的氧化的5-甲基胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基的方法，包括使含有选自5-羧甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶及其组合的至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基的细胞游离DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷有效地使所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱甲酰基，从而提供二氢尿嘧啶残基代替它。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180214 US 62/630,7981.一种用于将细胞游离DNA中的氧化的5-甲基胞嘧啶残基转化为二氢尿嘧啶残基的方法，包括使含有选自5-羧甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶及其组合的至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基的细胞游离DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷有效地使所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱甲酰基，从而提供二氢尿嘧啶残基代替它。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-羧甲基胞嘧啶。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-甲酰基胞嘧啶。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-羧甲基胞嘧啶和5-甲酰基胞嘧啶的组合。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述有机硼烷包含硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述氮杂环包含任选经1-4个低级烷基取代的吡啶。


8.根据权利要求7所述的方法，其中所述氮杂环包含吡啶、2-甲基吡啶或5-乙基-2-甲基吡啶。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述氮杂环包含2-甲基吡啶，并且所述有机硼烷是2-甲基吡啶硼烷。


10.根据权利要求5所述的方法，其中所述有机硼烷包含硼烷和叔胺的络合物。


11.根据权利要求10所述的方法，其中所述叔胺选自三乙胺和三(叔丁基)胺。


12.根据权利要求1所述的方法，其中还原、脱氨基和脱羧基在不分离任何中间体的情况下进行。


13.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在不存在亚硫酸氢盐的情况下进行。


14.一种反应混合物，其包含：
(a)含有选自5-羧甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶及其组合的至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基的细胞游离DNA样品；和
(b)有机硼烷，所述有机硼烷有效地使所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱甲酰基。


15.根据权利要求14所述的混合物，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-羧甲基胞嘧啶。


16.根据权利要求14所述的混合物，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-甲酰基胞嘧啶。


17.根据权利要求14所述的混合物，其中所述至少一种氧化的5-甲基胞嘧啶残基包含5-羧甲基胞嘧啶和5-甲酰基胞嘧啶的组合。


18.根据权利要求15至17中任一项所述的混合物，其中所述有机硼烷包含硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物。


19.根据权利要求18所述的混合物，其中所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物。


20.根据权利要求19所述的混合物，其中所述氮杂环包含任选经1-4个低级烷基取代的吡啶。


21.根据权利要求20所述的混合物，其中所述氮杂环包括吡啶、2-甲基吡啶或5-乙基-2-甲基吡啶。


22.根据权利要求21所述的混合物，其中所述氮杂环包含2-甲基吡啶，并且所述有机硼烷是2-甲基吡啶硼烷。


23.根据权利要求18所述的混合物，其中所述有机硼烷包含硼烷和叔胺的络合物。


24.根据权利要求23所述的混合物，其中所述叔胺选自三乙胺和三(叔丁基)胺。


25.根据权利要求14所述的混合物，其中所述混合物基本上不含亚硫酸氢盐。


26.一种用于检测细胞游离DNA中5-甲基胞嘧啶残基的存在和位置的方法，其中所述方法包括：
(a)对片段化的接头连接的细胞游离DNA中的5-羟甲基胞嘧啶残基进行修饰以在其上提供亲和标签，其中所述亲和标签使得能够从所述细胞游离DNA中除去含有经修饰的5-羟甲基胞嘧啶的DNA；
(b)从所述细胞游离DNA中除去所述含有经修饰的5-羟甲基胞嘧啶的DNA，留下含有未经修饰的5-甲基胞嘧啶残基的DNA；
(c)使所述未经修饰的5-甲基胞嘧啶残基氧化，以得到含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA；
(d)使所述含有氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA与有机硼烷接触，所述有机硼烷有效地使所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基还原、脱氨基和脱羧基或脱甲酰基，从而提供含有二氢尿嘧啶残基代替所述氧化的5-甲基胞嘧啶残基的DNA；
(e)对所述含有二氢尿嘧啶残基的DNA进行扩增和测序；
(f)从(e)的测序结果确定5-甲基化模式。


27.根据权利要求26所述的方法，还包括：
(g)鉴定在步骤(b)中从所述细胞游离DNA样品中除去的所述含有5-羟甲基胞嘧啶的DNA的羟甲基化模式。


28.根据权利要求26或27所述的方法，其中步骤(a)至(d)在不存在亚硫酸氢盐的情况下进行。


29.根据权利要求26或27所述的方法，其中步骤(a)至(d)在不分离任何中间体的情况下进行。


30.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述亲和标签包含生物素，并且步骤(a)包括用生物素选择性标记5-羟甲基胞嘧啶残基。


31.根据权利要求30所述的方法，其中步骤(b)包括使生物素化的DNA与支撑物结合的链霉亲合素接触。


32.根据权利要求26或27所述的方法，其中步骤(c)以酶促方式进行。


33.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：PA阿伦斯多夫，D斯帕克，C宋，
申请(专利权)人：蓝星基因组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US