【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自单个生物样品的蛋白质、核糖体和无细胞核酸的同时基于测序的分析
本专利技术一般地涉及表观遗传学分析，并且更具体地涉及用于从单个生物样品获得多种类型信息的组合工作流程方法。本专利技术发现可用于基因组学、医学、诊断学和表观遗传学研究的领域。技术背景从包含微量分析物的相对较小的生物样品中获取大量信息具有独特的挑战。例如，无细胞DNA(cfDNA)样品通常每毫升血浆仅包含几纳克的DNA。结果是，难以评估无细胞DNA样品的多于一个或两个特征，例如DNA序列信息和/或甲基化数据，每个特征经常使用单独的工作流程，将已少量的DNA样品分开作为输入，并且限制了可获知的关于同一起始分子的信息量(例如，如果单个起始cfDNA片段模板包含甲基化细胞因子和羟甲基化细胞因子二者)。然而，已经提出了一种用于从一个cfDNA样品中获得不同类型信息的方法。参见，例如，Arensdorf等的于2018年2月14日提交的临时美国专利申请序列号62/630,798的“MethodsfortheEpigeneticAnalysisofDNA,ParticularlyCell-FreeDNA”(BluestarGenomics,Inc.)，其描述了一种用于检测单个无细胞DNA样品中的不同表观遗传学特征的方法，包括DNA片段的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)残基的存在和位置，其中最终将经差异加工的DNA片段合并并一起测序以提供期望的信息；以及Song等的美国专利公开号2017/0298422A1的“SimultaneousSi...
【技术保护点】
1.一种改进的邻近延伸测定法，其通过提供多种探针对来鉴定生物样品中的多种蛋白质分析物，每种探针对包含第一邻近探针和第二邻近探针，其中每种探针对靶向特定蛋白质分析物，并且在相应的蛋白质分析物的存在下在每种探针对的探针之间产生双链DNA(dsDNA)片段，所述改进包括：/n(a)将用作蛋白质标识符条形码的蛋白质特异性核酸序列掺入所述dsDNA片段中，从而形成蛋白质条形码化的dsDNA模板分子；/n(b)对所述蛋白质条形码化的dsDNA模板分子进行扩增和测序；和/n(c)从步骤(b)中产生的序列读取中观察到的所述蛋白质标识符条形码中鉴定所述生物样品中的蛋白质分析物。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181004 US 62/741,4731.一种改进的邻近延伸测定法，其通过提供多种探针对来鉴定生物样品中的多种蛋白质分析物，每种探针对包含第一邻近探针和第二邻近探针，其中每种探针对靶向特定蛋白质分析物，并且在相应的蛋白质分析物的存在下在每种探针对的探针之间产生双链DNA(dsDNA)片段，所述改进包括：
(a)将用作蛋白质标识符条形码的蛋白质特异性核酸序列掺入所述dsDNA片段中，从而形成蛋白质条形码化的dsDNA模板分子；
(b)对所述蛋白质条形码化的dsDNA模板分子进行扩增和测序；和
(c)从步骤(b)中产生的序列读取中观察到的所述蛋白质标识符条形码中鉴定所述生物样品中的蛋白质分析物。
2.根据权利要求1所述的改进的邻近延伸测定法，其中每个蛋白质特异性核酸序列包含在衔接子内，并且步骤(a)包括将所述衔接子与所述dsDNA片段末端连接。
3.根据权利要求1所述的改进的邻近测定法，其中步骤(a)还包括将包含5hmC残基的捕获序列掺入所述dsDNA片段中，从而形成包含所述捕获序列的蛋白质条形码化的dsDNA模板分子。
4.根据权利要求3所述的改进的邻近延伸测定法，其中所述捕获序列和所述蛋白质标识符条形码包含在至少一个与所述dsDNA片段末端连接的衔接子内。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的改进的邻近延伸测定法，其还包括在步骤(b)之前，将随机核酸序列掺入每个dsDNA模板分子中以用作分子条形码。
6.根据权利要求5所述的改进的邻近延伸测定法，其还包括在步骤(b)之前，将至少一种蛋白质浓度对照组合物与所述dsDNA模板分子组合。
7.根据权利要求6所述的改进的邻近延伸测定法，其中每种蛋白质分析物以原始浓度存在于所述生物样品中，并且所述测定法还包括(d)通过将指示特定蛋白质分析物的序列读取与由所述蛋白质浓度对照组合物产生的序列读取比较来测定所述样品中至少一种蛋白质分析物的原始浓度。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的改进的邻近延伸测定法，其还包括并行地检测多个生物样品中每一个中的多种蛋白质分析物。
9.根据权利要求7所述的改进的邻近延伸测定法，其还包括并行地检测多个生物样品中每一个中的多种蛋白质分析物。
10.根据权利要求9所述的改进的邻近延伸测定法，其中所述多个生物样品包括至少300个生物样品。
11.根据权利要求10所述的改进的邻近延伸测定法，其中所述多个生物样品包括至少500个生物样品。
12.根据权利要求11所述的改进的邻近延伸测定法，其中所述多个生物样品包括至少1000个生物样品。
13.根据权利要求9所述的改进的邻近延伸测定法，其中所述多个生物样品包括384或1536个生物样品，并且所述测定法是每个生物样品在微板的单个孔中进行的。
14.一种使用基于DNA测序的技术鉴定生物样品中的多种蛋白质分析物的方法，所述方法包括：
(a)提供多种探针对，每种探针对靶向特定蛋白质分析物，并且包含在第一末端的蛋白质结合结构域、在相对的第二末端的核酸结合结构域和在其之间的非杂交核酸区域，其中(i)第一邻近探针和第二邻近探针的蛋白质结合结构域能够同时与同一蛋白质分析物上的不同结合位点结合，并且(ii)所述探针的核酸结合结构域彼此互补并且当所述第一邻近探针和所述第二邻近探针都与所述蛋白质结合并且足够邻近以发生杂交时杂交以形成dsDNA片段；
(b)在有效促进以下项的条件下用所述探针对孵育所述生物样品或其级分：(i)探针对中每个邻近探针的蛋白质结合结构域与相应的蛋白质分析物结合和(ii)核酸结合结构域彼此杂交以形成dsDNA片段，所述dsDNA片段具有源自所述第一邻近探针的5'末端和源自所述第二邻近探针的3'末端；
(c)通过添加聚合酶和dNTP的混合物将所述第一邻近探针的5'末端沿着所述第二邻近探针延伸，以在所述探针之间产生dsDNA片段，所述dsDNA片段掺入用作蛋白质标识符条形码的蛋白质特异性核酸序列和包含5hmC残基的捕获序列，其中(i)所述第一探针、所述第二探针或所述第一探针和所述第二探针二者的核酸结合区域包含所述捕获序列、所述蛋白质标识符条形码或所述捕获序列和所述蛋白质标识符条形码二者；(ii)所述dNTP的混合物包含至少一种5hmC残基；和/或(iii)在聚合酶延伸后将衔接子连接至所述dsDNA片段的末端，其中至少一个衔接子包含所述捕获序列、所述蛋白质标识符条形码或所述捕获序列和所述蛋白质标识符条形码二者，从而形成蛋白质-条形码化的dsDNA模板分子，每个dsDNA模板分子包含捕获序列；
(d)对包含捕获序列的所述蛋白质条形码化的dsDNA模板分子进行扩增和测序；以及
(e)从步骤(b)中产生的序列读取中观察到的蛋白质标识符条形码中鉴定所述生物样品中的蛋白质分析物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中每个蛋白质结合结构域包含抗原，并且每个结合位点包含表位。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述生物样品包括血液样品，并且步骤(b)在所述血液样品的级分上进行。
17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(b)在从所述血液样品获得的血浆上进行。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其还包括获得关于从所述生物样品获得的无细胞核酸样品的信息。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述信息包括所述无细胞核酸样品中的核小体内的一种或更多种组蛋白修饰的存在、鉴定或数量。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一种或更多种组蛋白修饰包括共价翻译后修饰(PTM)。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述PTM包括影响基因表达的组蛋白结构改变。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述至少一种PTM包括乙酰化、甲基化、丙酰化、丁酰化、巴豆酰化、2-羟基异丁酰化、丙二酰化、琥珀酰化、甲酰化、泛素化、瓜氨酸化、磷酸化、羟化、类泛素化、O-GlcNAc糖基化、ADP核糖基化或其组合。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述一种或更多种组蛋白修饰包括用于评估受试者的疾病状态的组蛋白修饰生物标志物。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述信息包括所述无细胞核酸样品中的至少一种无细胞DNA(cfDNA)序列。
25.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述信息还包括所述无细胞核酸样品中的至少一种cfDNA序列。
26.根据权利要求18所述的方法，其中所述信息包括所述无细胞核酸样品中的至少一种无细胞RNA(cfRNA)序列。
27.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述信息还包括所述无细胞核酸样品中的至少一种cfRNA序列。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述信息还包括所述无细胞核酸样品中的至少一种cfRNA序列。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述信息还包括所述无细胞核酸样品中的至少一种cfRNA序列。
30.根据权利要求18所述的方法，其中，所述信息包括表观遗传学数据。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述信息关于DNA羟甲基化。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述信息关于DNA甲基化。
33.根据权利要求31所述的方法，其中，所述信息另外地关于DNA甲基化。
34.一种使用基于DNA测序的技术制备无细胞核酸样品以能够鉴定其中所含核小体中的至少一种组蛋白修饰的方法，所述方法包括：
(a)提供无细胞核酸样品，其包含多种核小体，每种核小体包含缠绕在组蛋白核心周围的cfDNA分子；
(b)将包含末端杂交区域的衔接子连接至所述cfDNA分子的末端，从而提供经修饰的无细胞核酸样品，其包含各自缠绕在组蛋白核心周围的连接有衔接子的cfDNA分子；
(c)提供邻近探针，所述邻近探针包含：在第一末端的与目标组蛋白修饰特异性结合的组蛋白修饰结合结构域；在第二末端的与末端杂交区域互补的核酸结合结构域；和在其之间的非杂交区域，其包含与目标组蛋白修饰相对应并且从而用作组蛋白修饰条形码的核酸序列，其中所述邻近探针的大小设置成同时允许所述组蛋白修饰结合结构域与所述目标组蛋白修饰结合并且所述互补核酸结合结构域与所述杂交核酸区域杂交；
(d)在有效促进以下项的条件下用所述邻近探针孵育所述经修饰的无细胞核酸样品：(i)所述组蛋白修饰结合结构域与所述组蛋白修饰结合和(ii)所述互补核酸结合结构域与所述杂交核酸区域杂交以形成dsDNA片段，所述dsDNA片段具有源自所述无细胞DNA的5'末端和源自所述邻近探针的3'末端并且包含所述组蛋白修饰条形码；以及
(e)通过添加聚合酶和dNTP的混合物将所述dsDNA片段的5'末端沿着所述邻近探针的非杂交区域和所述组蛋白修饰条形码延伸，从而提供用于扩增和测序的组蛋白修饰条形码化的dsDNA模板分子。
35.根据权利要求34所述的方法，其中步骤(c)包括提供多种邻近探针，每种邻近探针靶向不同的组蛋白修饰。
36.根据权利要求35所述的方法，其还包括对所述组蛋白修饰条形码化的dsDNA模板分子进行扩增。
37.根据权利要求36所述的方法，其还包括对经扩增的组蛋白修饰条形码化的dsDNA模板分子进行测序，并且从产生的序列读取中观察到的组蛋白修饰条形码测定关于组蛋白修饰的类型和位置的信息。
38.一种制备用于从无细胞核酸样品中提取的cfDNA的方法，其中所述方法包括：
(a)将包含捕获序列的DNA衔接子连接至所述无细胞核酸样品中的末端钝化DNA的末端，以提供连接有衔接子的DNA，所捕获序列包含5hmC残基；以及
(b)用亲和标签将所述5hmC残基官能化，所述亲和标签允许选择性去除标签化的cfDNA。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述亲和标签由生物素组成，并且步骤(b)包括将所述至少一种5hmC残基生物素化以形成生物素化的连接有衔接子的cfDNA。
40.根据权利要求39所述的方法，其中通过将化学选择性基团共价附接至所述5hmC残基并且然后使所述化学选择性基团与官能化的生物素部分反应来将所述5hmC残基生物素化。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述化学选择性基团是UDP葡萄糖-6-叠氮化物，并且所述官能化的生物素部分是炔烃官能化的生物素，使得所述化学选择性基团在点击化学反应中与所述官能化的生物素反应。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述衔接子另外地包含独特特征标识符(UFI)序列。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述衔接子包含至少两种UFI序列。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述至少两种UFI序列包含源标识符条形码和选自分子条形码、链标识符条形码和组蛋白修饰条形码的至少一种另外的UFI序列。
45.一种在单个无细胞核酸样品中制备DNA和RNA用以同时进行基于测序的鉴定的方法，其中所述方法包括：
(a)将包含第一衔接子序列的DNA衔接子连接至所述无细胞样品中的末端钝化DNA的末端以提供连接有衔接子的DNA，所述第一衔接子序列包含至少一种UFI序列，其中所述至少一种UFI序列包含源标识符条形码；
(b)将所述连接有衔接子的DNA和RNA纯化，以提供所述连接有衔接子的DNA和RNA的无细胞混合物；
(c)从所述RNA合成cDNA的第一链；
(d)合成cDNA的与所述第一链互补的第二链以提供cDNA双链体；以及
(e)在不存在连接酶的情况下，将包含第二衔接子序列的cDNA衔接子共价附接至所述cDNA双链体的至少一个末端，所述第二衔接子序列包含所述源标识符条形码和RNA指示剂条形码，从而在无细胞混合物中提供衔接子结合的cDNA，所述无细胞混合物还包含所述连接有衔接子的DNA。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述至少一种UFI序列另外地包含分子条形码、链标识符条形码、组蛋白修饰条形码或其组合。
47.一种用于从单个无细胞核酸样品中提取多种类型数据的组合工作流程方法，其中所述方法包括：
(a)将包含第一衔接子序列的DNA衔接子连接至所述样品中的末端钝化cfDNA的末端上以提供连接有衔接子的DNA，所述第一衔接子序列包含至少一种UFI序列，其中所述至少一种UFI序列包含源标识符条形码；
(b)从所述样品中的RNA合成cDNA，并且将包含所述源标识符条形码和RNA指示剂条形码的cDNA衔接子共价附接至所述cDNA的至少一个末端，从而在无细胞混合物中提供衔接子结合的cDNA，所述无细胞混合物还包含所述连接有衔接子的DNA；
(c)用亲和标签将所述样品中的5hmC残基官能化，所述亲和标签允许从所述无细胞样品中选择性去除含5hmC的DNA；
(d)从所述无细胞样品中去除所述含5hmC的DNA，其中未标签化的DNA和衔接子结合的cDNA保留在所述样品中；
(e)将5hmC过程条形码附加到所述含5hmC的DNA；以及
(f)对所述含5hmC的DNA、所述未标签化的DNA和所述衔接子结合的cDNA进行扩增和测序。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述至少一种UFI序列另外地包含分子条形码、链标识符条形码、组蛋白修饰条形码或其组合。
49.根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中在扩增之前，将步骤(e)中提供的所述含5hmC的DNA与所述未标签化的DNA和所述衔接子结合的cDNA合并。
50.一种用于从单个无细胞核酸样品中提取多种类型数据的组合工作流程方法，其中所述方法包括：
(a)将包含第一衔接子序列的DNA衔接子连接至所述样品中的末端钝化cfDNA的末端上以提供连接有衔接子的DNA，所述第一衔接子序列包含至少一种UFI序列，所述至少一种UFI序列包含源标识符条形码；
(b)从所述样品中的RNA合成cDNA，并且将包含所述源标识符条形码和RNA指示剂条形码的cDNA衔接子共价附接至所述cDNA的至少一个末端，从而提供衔接子结合的cDNA；
(c)用第一亲和标签将所述样品中的5hmC残基官能化，所述第一亲和标签允许从所述无细胞样品中选择性去除含5hmC的DNA；
(d)去除所述标签化的含5hmC的DNA，其中未标签化的含5hmC的DNA、未标签化的未经修饰的DNA和衔接子结合的cDNA保留在所述样品中；
(e)将5hmC过程条形码附加到所述标签化的含5hmC的DNA；以及
(f)将剩余样品中的甲基胞嘧啶残基转化为氧化的甲基胞嘧啶残基；
(g)用第二亲和标签将所述氧化的甲基胞嘧啶残基官能化，所述第二亲和标签允许从所述样品中选择性去除官能化的物质；
(h)去除所述标签化的含5mC的DNA，其中未标签化的DNA和衔接子结合的cDNA保留在所述样品中；
(i)将5mC过程条形码附加到所述标签化的含5mC的DNA；以及
(j)对所述标签化的含5hmC的DNA、所述标签化的含5mC的DNA、所述未标签化的DNA和所述衔接子结合的cDNA进行扩增和测序。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种分子条形码还包含片段标识符序列、链标识符序列或片段标识符序列和链标识符序列二者。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的方法，其中在测序之前，将所述标签化的含5hmC的DNA和所述标签化的含5mC的DNA与所述未标签化的DNA和所述衔接子结合的cDNA合并。
53.一种用于从单个无细胞核酸样品中提取至少两种类型数据的组合工作流程方法，其中所述方法包括：
(a)将包含第一衔接子序列的DNA衔接子连接至所述样品中的末端钝化DNA的末端上以提供连接有衔接子的DNA，所述第一衔接子序列包含至少一种分子条形码，所述至少一种分子条形码包含源标识符条形码；
(b)从所述样品中的RNA合成cDNA，并且将包含5hmC残基、所述源标识符条形码和RNA指示剂条形码的cDNA衔接子共价附接至所述cDNA的至少一个末端，从而提供条形码化的衔接子结合的cDNA；
(c)用亲和标签将所述样品中的5hmC残基官能化，所述亲和标签允许从所述无细胞样品中选择性去除含5hmC的物质；
(d)从所述无细胞样品中去除所述含5hmC的DNA和所述条形码化的衔接子结合的cDNA；以及
(e)对所述含5hmC的DNA和所述条形码化的衔接子结合的cDNA的合并混合物进行扩增和测序以提供同一样品中的关于DNA羟甲基化和cfRNA的数据。
54.一种用于从单个无细胞核酸样品中提取多种类型数据的组合工作流程方法，所述方法包括：
(a)将包含杂交核酸区域的衔接子连接至核小体相关DNA的每个末端...
【专利技术属性】
技术研发人员：PA阿伦斯多夫，D斯帕塞克，CE艾莉森，S莱维，
申请(专利权)人：蓝星基因组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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