复用型催化报告分子沉积制造技术

提供了一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括复用型催化报告分子沉积(CARD)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】复用型催化报告分子沉积相关申请的交叉引用本申请要求2018年6月8日提交的美国临时申请号62/682,765以及2018年11月13日提交的美国临时申请号62/760,450的优先权益，所有申请的内容均出于任何目的以引用的方式整体并入本文。
本申请总体上涉及分析物(例如，靶标)检测领域，并且具体地涉及使用催化报告分子沉积(CARD)的检测方法。
技术介绍
对于研究和医学应用，可能需要检测单个细胞或组织样品内的多个生物学相关分子。免疫学方法通常用于此目的。此类方法总体涉及将抗体与样品中的目标分子结合，生成与抗体相关联的可检测信号以使得每个目标分子彼此区分开，以及使用分析方法检测信号。在此类免疫学方法中已使用催化报告分子沉积(CARD)来产生与抗体相关联的增强信号。CARD的典型工作流程是将靶标分子-特异性抗体施用于样品，然后施用识别一级抗体的二级抗体。二级抗体连接到酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶)，所述酶将底物转化为与附近的酚类残基结合的反应剂(例如酪氨酸)。因为细胞样品中酚类残基十分丰富，因此结果是在一级抗体附近有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：/n(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；/n(2)在一个或两个步骤中，使所述样品与(a)连接到核酸链的酶和(b)中间部分接触，所述中间部分包含能够与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链特异性结合的第一结构域；和能够与连接到所述酶的所述核酸链特异性结合的第二结构域；/n(3)使来自步骤(2)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用可释放接...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180608 US 62/682,765;20181113 US 62/760,4501.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)在一个或两个步骤中，使所述样品与(a)连接到核酸链的酶和(b)中间部分接触，所述中间部分包含能够与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链特异性结合的第一结构域；和能够与连接到所述酶的所述核酸链特异性结合的第二结构域；
(3)使来自步骤(2)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用可释放接头来连接；
(4)任选地使所述结合的酶失活；
(5)任选地检测来自所述结合的可检测标记的信号；以及
(6)任选地重复步骤(1)-(5)或其子集，并且在成像的步骤(5)之前任选地重复步骤(3)-(4)或其任何子集。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述中间部分的第二区域包含重复序列，每个所述序列都直接或间接地与连接到所述酶的所述核酸链的对应序列特异性结合。


3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括通过核酸扩增反应来扩增与连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链结合的所述中间部分，以形成重复序列的扩增子，每个所述序列都直接或间接地与连接到所述酶的所述核酸链的对应序列特异性结合。


4.如权利要求3所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括基于发夹的串联聚合反应或基于发夹的树突聚合反应，任选地所述扩增反应是引物交换反应。


5.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地使所述结合的酶失活；
(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(8)之前重复步骤(1)-(7)或其任何子集。


6.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的结合对的第一成员接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的结合对的未结合的第一成员；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与连接到酶的所述结合对的第二成员接触，并任选地去除连接到所述酶的所述结合对的未结合的第二成员；
(6)使来自步骤(5)的所述样品与包含标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述标记任选地使用可释放接头来连接；
(7)任选地去除未结合的底物缀合物；
(8)任选地使所述结合的酶失活；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(10)任选地重复步骤(1)-(9)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。


7.如权利要求6所述的方法，其还包括(11)在步骤(9)之后通过裂解所述标记与所述底物之间的所述可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(9)和(11)中的任一者。


8.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含核酸链结合底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述核酸链任选地使用第一可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地使所述结合的酶失活；
(8)使来自步骤(5)或任选地步骤(6)-(7)的所述样品与核酸链结合的可检测标记接触，所述可检测标记任选地使用第二可释放接头来连接，其中所述核酸链是步骤(5)中的所述核酸链的特异性结合对成员；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的标记；
(10)任选地通过释放步骤(5)或任选地步骤(8)或任选地步骤(5)和(8)的所述接头来任选地释放来自步骤(8)的所述结合的标记；以及
(11)任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。


9.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，所述方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种靶标特异性结合配偶体接触，其中所述靶标特异性结合配偶体连接到核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使所述样品与辣根过氧化物酶(HRP)结合的核酸链接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的含酚底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物；
(7)任选地使所述HRP失活；
(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在步骤(8)之前重复步骤(1)-(7)或其子集。


10.如权利要求1所述的方法，其中所述酶使用酶失活剂来使其失活，其中所述酶失活剂包括二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、还原型谷胱甘肽、过氧化物、氰化物、氟化物或叠氮化物。


11.如权利要求1所述的方法，其中使所述结合的酶失活的步骤(4)进行少于20分钟。


12.如权利要求1所述的方法，其中使所述结合的酶失活的步骤(4)进行少于10分钟。


13.如权利要求1所述的方法，其中使所述结合的酶失活的步骤(4)进行少于2分钟。


14.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地释放所述结合的酶；
(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(8)之前重复步骤(1)-(7)或其任何子集。


15.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(3)中，包含所述可检测地标记的底物的所述底物缀合物与所述酶反应以形成活化的底物缀合物，并且所述活化的底物缀合物与所述活化的底物缀合物的受体结合。


16.如权利要求15所述的方法，其中所述活化的底物缀合物的所述受体存在于所述样品中，从而导致所述可检测标记沉积。


17.如权利要求5所述的方法，其还包括(10)在步骤(8)之后通过释放所述第三可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集。

【专利技术属性】
技术研发人员：M·博布罗，S·亨内克，M·马内斯，
申请(专利权)人：乌尔蒂维尤股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US