采用猝灭剂的定量扩增归一化制造技术

提供用于定量聚合酶链反应(PCR)扩增归一化的组合物、试剂盒和方法。还提供用于在同一孔中对两个或更多个靶核酸进行多重qPCR扩增的组合物、试剂盒和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】采用猝灭剂的定量扩增归一化相关申请的交叉引用本申请要求2018年3月15日提交的第62/643,506号美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
技术介绍
优化条件下的定量聚合酶链反应(qPCR)基于PCR反应过程中的荧光生成产生定量结果。荧光生成的主要方法是酶促裂解探针或将染料嵌入双链DNA。定量的准确性会受多种因素影响，包括反应效率或抑制剂的存在。实验样品中相对于对照的反应效率失准会造成定量过高或定量偏低。专利技术概述一方面，提供用于qPCR扩增归一化的组合物、试剂盒和方法。一些实施方式中，用于qPCR扩增归一化的组合物包含：特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，并且所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭对照核酸扩增产物发出的所有或基本上所有荧光；和特异性关联对照核酸的可检测探针。一些实施方式中，正向猝灭引物和/或反向猝灭引物包含两个猝灭剂。一些实施方式中，正向猝灭引物和/或反向猝灭引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定量聚合酶链反应(PCR)扩增归一化的组合物，包含：/n特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，并且所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭对照核酸扩增产物发出的所有或基本上所有荧光；/n特异性关联对照核酸的可检测探针；和/n对照核酸，其中，所述对照核酸包含与所述正向猝灭引物结合的正向引物结合位点，与所述可检测探针结合的探针结合位点以及与所述反向猝灭引物结合的反向引物结合位点。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180315 US 62/643,5061.一种用于定量聚合酶链反应(PCR)扩增归一化的组合物，包含：
特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，并且所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭对照核酸扩增产物发出的所有或基本上所有荧光；
特异性关联对照核酸的可检测探针；和
对照核酸，其中，所述对照核酸包含与所述正向猝灭引物结合的正向引物结合位点，与所述可检测探针结合的探针结合位点以及与所述反向猝灭引物结合的反向引物结合位点。


2.如权利要求1所述的组合物，包含：
特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；
特异性关联对照核酸的可检测探针；和
对照核酸，其中，所述对照核酸包含与所述正向猝灭引物结合的正向引物结合位点，与所述可检测探针结合的探针结合位点以及与所述反向猝灭引物结合的反向引物结合位点。


3.如权利要求1或2所述的组合物，其中：
就正向猝灭引物而言，所述第一猝灭剂位于5'末端或距5'末端5个碱基以内，所述第二猝灭剂距3'末端5-10个碱基以内；且/或
就反向猝灭引物而言，所述第一猝灭剂位于5'末端或距5'末端5个碱基以内，所述第二猝灭剂距3'末端5-10个碱基以内。


4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中：
就正向猝灭引物而言，所述第一猝灭剂和所述第二猝灭剂相隔至多约25个碱基；且/或
就反向猝灭引物而言，所述第一猝灭剂和所述第二猝灭剂相隔至多约25个碱基。


5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述可检测探针直接结合对照核酸。


6.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述可检测探针与所述正向猝灭引物和/或所述反向猝灭引物接合。


7.如权利要求6所述的组合物，还包含与所述引物上可检测探针接合部分杂交的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。


8.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述可检测探针与杂交所述正向猝灭引物或所述反向猝灭引物一部分的寡核苷酸接合。


9.如权利要求8所述的组合物，还包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂，其中，所述猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂与(i)可检测探针接合的寡核苷酸或(ii)与所述寡核苷酸杂交的引物接合。


10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，还包含荧光DNA嵌入剂。


11.如权利要求10所述的组合物，其中，所述荧光DNA嵌入剂是SYBRGreenI、EvaGreen、picogreen、溴乙锭、SYBRGold、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO或BEBO。


12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述荧光DNA嵌入剂是SYBRGreenI。


13.如权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中，所述可检测探针包含发射光谱可区分于所述荧光DNA嵌入剂发射光谱的荧光染料。


14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中，所述可检测探针包含选自以下物质的荧光染料：Cy3、Cy5、FAM、HEX、JOE、QUASAR、罗丹明、ROX、TAMRA、TET、德克萨斯红、TYE和VIC。


15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述可检测探针包含水解探针。


16.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，还包含一种或多种缓冲剂、盐、核苷酸、引物、聚合酶和/或水。


17.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，所述组合物是溶液。


18.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，所述组合物是冻干组合物。


19.一种固相支持物，包含一个或多个分区，所述一个或多个分区各自包含权利要求1至18中任一项所述的组合物。


20.一种试剂盒，包含权利要求1至18中任一项所述的组合物或权利要求19所述的固相支持物。


21.一种对qPCR扩增相对于对照进行归一化的方法，所述方法包括：
将靶核酸和对照核酸与以下物质合并形成反应混合物：(i)荧光DNA嵌入剂、(ii)包含靶核酸特异性正向引物和靶核酸特异性反向引物的靶核酸特异性引物组、(iii)特异性关联对照核酸的可检测探针和(iv)包含正向猝灭引物和反向猝灭引物的特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，其中，所述正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭对照核酸扩增产物发出的所有或基本上所有荧光；
在适合产生靶核酸扩增子和对照核酸扩增子的条件下孵育所述反应混合物，所述荧光DNA嵌入剂既结合靶核酸扩增子也结合对照核酸扩增子，并且，产生的对照核酸扩增子包含多个掺入所述扩增子内的猝灭剂；
激发所述荧光DNA嵌入剂，掺入所述对照核酸扩增子内的猝灭剂猝灭与对照核酸扩增子结合的荧光DNA嵌入剂所发出荧光的至少部分；和
检测所述靶核酸扩增子和所述对照核酸扩增子，其中，通过检测荧光DNA嵌入剂发出的荧光信号来检测靶核酸扩增子，并且通过检测可检测探针来检测对照核酸扩增子。


22.如权利要求21所述的方法，所述正向猝灭引物和所述反向猝灭引物中各自包含位于或靠近所述引物5'末端的第一猝灭剂和靠近所述引物3'末端的第二猝灭剂。


23.如权利要求21或22所述的方法，其中，所述可检测探针直接结合对照核酸。
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【专利技术属性】
技术研发人员：E·赫夫纳，Y·乔夫诺，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US