高剪切固相合成制造技术

本公开涉及有机分子的固相合成，并且尤其涉及使用固相合成来合成聚合物的高效方法，例如肽、核苷酸或糖。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高剪切固相合成
本公开总体上涉及固相合成以及使用固相合成法合成肽和其他分子的方法的领域。
技术介绍
肽类药物有许多应用。市场上大约有100种已获批准的肽类药物，其中有几种大片药物，如生长抑素类似物奥曲肽。肽类药物最流行和占主导地位的领域包括HIV治疗、糖尿病、癌症治疗，并且在神经系统紊乱(例如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病)以及自身免疫性疾病(例如狼疮、类风湿关节炎和葡萄膜炎)领域中的应用也不断产生。在制药工业中，习惯使用三种主要方法来制备大量肽：重组技术；液相化学合成和固相肽合成(SPPS)。由于原料成本低和规模经济，SPPS是肽的首选制造方法。固相化学方法生产从克到100Kg规模的相对短的肽(通常长达约50个氨基酸长)的速度更快且成本更低，并且更适合于早期临床开发。SPPS方法是多步骤链方法，其涉及两种主要类型(即阶段或步骤)的反应：(i)除去临时保护基(脱保护)和(ii)氨基酸偶联。这些反应一个接一个地依次发生，并进行中间洗涤以除去未反应的试剂和可溶性副产物。通常，在固相合成中，在不溶性聚合树脂上构建一系列结构单元，所述不溶性聚合树脂具有对所述结构单元具有反应性的连接单元。由于某些结构单元，例如氨基酸包含至少两个彼此反应的官能团(即氨基和羧酸根基团)，因此通常预先保护一个基团(通常是氨基)，以使游离的羧酸根基团与连接单元反应，而不是与另一个存在的氨基酸反应。为了使氨基酸链延续，对氨基进行脱保护，从而产生具有第一氨基酸的树脂，可用于与连续的N-保护的氨基酸反应。重复该过程，直到获得所需数量的结构单元为止。使用不溶性树脂的目的是使简单的洗涤过程成为可能，该过程只需清洗所有过量的可溶试剂以及副产物，同时保持所需的产物附着在不溶性树脂上。因此，最后的合成步骤是除去侧链保护基并切下结构单元链(肽)，并将其与不溶性树脂分离。因此，聚合物分子的固相合成通常包括以下合成步骤：(a)官能化的树脂聚合物珠粒的溶胀；(b)将第一被保护的单体单元偶联到官能化的树脂上；(c)洗涤过量的第一被保护的单体单元；(d)使用脱保护剂对与步骤(b)中形成的与第一单体连接的树脂进行脱保护，从而形成与第一脱保护单体连接的树脂；和(e)洗涤过量的脱保护剂。然后对随后的被保护的单体循环重复步骤(b)-(e)，从而形成树脂-聚合物分子。因此，步骤(b)-(e)被认为是一个循环，其中总固相合成通常包括多个循环。最后，将所需的产物分子从树脂上切下并与树脂分离，从而获得最终的聚合物产物。用于固相合成的树脂通常是不溶的聚合物，经化学反应性官能团改性。这些官能团在化学上适合与要掺入目标产物寡聚物/聚合物中的第一单体偶联。所述第一单体以及其他顺序单体通常包括至少两个彼此反应的官能团。然而，在这些官能团之一上放置保护基将所述转化限制为将被保护的单体单元偶联到树脂，从而形成最初与第一单体连接并在许多类似的循环之后与单体的构建体连接的树脂。通常，为了确保反应完成，在一系列的循环中的每个被保护单体被过量(相对于与树脂结合的分子而言)使用。典型地，也过量(相对于与树脂结合的单体分子而言)使用脱保护剂，以确保反应完成。自1963年布鲁斯·梅里菲尔德(BruceMerrifield)专利技术SPPS(Merrifield，R.B.(1963)J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154)以来，引入了许多方法来改进该技术。这些方法大多数基于偶联剂的化学修饰(Pattabiraman等，Nature(2011)480，471-479)。其他改进包括热方法，例如微波和加热(Collins等，(2014)Org.Lett.16，940-943)。然而，关于水动力参数对SPPS中产率和副反应影响的研究很少。多肽的二级和三级结构对剪切力特别敏感。当受到剪切作用时，肽分子的二级和/或三级结构可能会不可逆地改变，从而可能导致生物活性丧失。如果肽分子受到足够的剪切力，则一级结构即氨基酸序列也可能被破坏或打断。考虑到这一点，合成肽的方法通常利用使肽分子暴露于剪切应力的过程最小化的程序。例如，EP0503683公开了一种“涡旋”搅动模式，该模式防止树脂附聚并允许总的流体-树脂相互作用而无需使用叶轮型机械搅动。根据该公开，在机械搅动下，由叶轮引起的剪切和树脂磨损可使树脂珠粒破碎成越来越小的颗粒，这些颗粒最终会堵塞过滤器，从而迫使合成过程中断。使用涡旋式搅动机，对树脂珠粒没有叶轮式剪切或磨损作用。在他的开创性论文(Merrifield，R.B.(1963)J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154)中，Merrifield使用磁力搅拌器来混合聚合树脂珠粒。事实证明，该方法将树脂珠粒破碎成小颗粒，从而阻塞了烧结玻璃过滤器并阻止了过滤。为了避免这个问题，Merrifield专利技术了一种由反应容器组成的手动装置，其中通过摇动而不是搅拌来混合反应物(Merrifield，R.B.SolidPhaseSysthesis(NobleLecture)，AngewandteChemieInternationalEdition(1985)24，799-892)。从那时起，肽的生产通常仅限于采用温和的混合方法，例如涡旋、氮气流、在旋转蒸发转子中旋转、摇摆搅动等。在大规模固相合成(SPS)玻璃反应器中，通常采用机械搅拌器在低转速下温和搅动树脂珠粒。这种搅拌器的叶轮是专为剪切速率非常低的搅动而设计的。固相合成通常用于肽和多肽的合成。然而，该方法决不限于此类化合物的合成，其他寡聚/聚合分子的制备，例如修饰的肽、拟肽、寡核苷酸、肽核酸分子、寡糖和小的有机分子都是通过固相合成来实现的。通常，可以通过固相合成来合成需要选择性保护/去保护、偶联和切断步骤的任何有机聚合物或分子(例如，Boncher等，(2013)Mod.Chem.appl.1：113)。固相寡核苷酸合成通常使用亚磷酰胺方法进行。在该方法中，亚磷酰胺结构单元衍生自被保护的2'-脱氧核苷核糖核苷或化学修饰的核苷。为了获得所需的寡核苷酸，将结构单元按所需顺序依次偶联至正在生长的寡核苷酸链。该方法涉及的结构单元是核苷的3'-O-(N,N-二异丙基亚磷酰胺)衍生物(核苷亚磷酰胺)。通常，将具有O保护基的树脂脱保护并与O保护的核苷亚磷酰胺偶联以形成P-O键(其中磷来自添加的结构单元，而氧最初是与树脂结合的反应物的一部分)。下一步通常涉及封端未反应的端基是O的树脂，以抑制副产物的形成。接下来，磷原子被氧合并且氧被脱保护，使得产物对进一步的结构单元反应。链组装完成后，产物从固相释放到溶液中、脱保护并收集。通常，合成寡核苷酸是长度约为15-25个碱基的单链DNA或RNA分子。寡糖的固相合成更加多样化，因为糖单元(即单糖单元)可以通过糖环不同位置的各种C-O键相互连接。但是，寡糖SPS策略与其他SPS方法学享有重复的脱保护-偶联循环的共同特征。Seeberger和Haase(Chem.Rev.，2000，100(12)，第4349-4394页)总结了不同的寡糖SPS工艺。对于以更高的效率和速度以及更低的副反应来大规模合成肽的改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于进行有机分子的固相合成的至少一个循环的方法，该方法包括步骤：/ni.提供包括反应室和搅拌装置的反应器，其中搅拌装置包括具有至少两个可绕轴旋转的叶片的叶轮；/nii.将官能化的聚合树脂珠粒和至少一种溶剂放入反应器中以提供反应混合物，其中所述反应混合物与可旋转的叶片接触；/niii.将至少一种反应物放入反应室中；/niv.以至少600转/分(rpm)的转速旋转叶轮一段时间，同时保持至少3×10

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180313 US 62/642,0161.一种用于进行有机分子的固相合成的至少一个循环的方法，该方法包括步骤：
i.提供包括反应室和搅拌装置的反应器，其中搅拌装置包括具有至少两个可绕轴旋转的叶片的叶轮；
ii.将官能化的聚合树脂珠粒和至少一种溶剂放入反应器中以提供反应混合物，其中所述反应混合物与可旋转的叶片接触；
iii.将至少一种反应物放入反应室中；
iv.以至少600转/分(rpm)的转速旋转叶轮一段时间，同时保持至少3×103s-1的剪切速率；
从而进行有机分子的固相合成的至少一个循环。


2.权利要求1所述的方法，其中所述搅拌装置是机械搅拌器，并且所述叶轮的旋转以600至1400转/分的转速进行，保持至少3×103s-1的剪切速率。


3.权利要求2所述的方法，其中所述转速在600-800rpm的范围内。


4.权利要求2所述的方法，其中所述叶轮的旋转包括在所述反应混合物中保持至少1.5N/m2的剪切应力。


5.权利要求2所述的方法，在所述反应混合物中产生1.5-5、1.8-3.8、1.8-3.0或1.8-2.4N/m2的剪切应力。


6.权利要求2所述的方法，其中所述机械搅拌器包括至少三个可绕轴旋转的叶片。


7.权利要求3所述的方法，其中所述可绕轴旋转的叶片以20-40°、25-35°或30-35°范围内的第一角度向上旋转。


8.权利要求1所述的方法，其中所述搅拌装置是均质机，并且所述叶轮的旋转以5,000-30,000转/分的转速进行，保持至少1×106s-1的剪切速率。


9.权利要求8所述的方法，其中所述转速为10,000-30,000rpm。


10.权利要求8所述的方法，其中所述叶轮的旋转包括保持500-2000N/m2的剪切应力。


11.权利要求8所述的方法，其中在反应混合物中保持750-1500或900-1200N/m2的剪切应力。


12.权利要求8所述的方法，其中所述均质机是转子-定子均质机。


13.权利要求1所述的方法，其中所述官能化的聚合树脂珠粒包括聚苯乙烯-二乙烯基苯。


14.权利要求13所述的方法，其中所述树脂选自1％DVB-PS氯甲基化树脂和RinkAmideTentagel树脂。


15.权利要求1所述的方法，所述官能化的聚合树脂珠粒包括0.2-0.6mmol/g的偶联容量。


16.权利要求1所述的方法，其中所述官能化的聚合树脂珠粒具有20-200μm的颗粒。


17.权利要求1所述的方法，其中所述有机分子是包含选自肽链、核苷酸链和糖的分子的聚合物。


18.权利要求1所述的方法，其中所述有机分子包含肽链。


19.权利要求17所述的方法，用于在聚合有机分子的固相合成中进行循环，其中所述方法包括步骤：
(a)提供包括反应室和搅拌装置的反应器，该搅拌装置包括具有至少两个可绕轴旋转的叶片的叶轮；
(b)将官能化的聚合树脂珠粒和至少一种溶剂放入反应器中以提供反应混合物，其中所述反应混合物与可旋转的叶片接触；
(c)将至少一种被保护的单体有机分子和至少一种偶联剂放入反应室中并旋转叶轮，从而形成被保护的单体有机分子与树脂的偶联产物；
(d)洗涤过量的所述被保护的单体有机分子；和
(e)将至少一种脱保护剂放入反应室中并旋转叶轮，从而从偶联产物中除去至少一个保护基，形成脱保护的单体有机分子与树脂的偶联产物，从而完成在聚合有机分子的固相合成中的一个循环；
其中以至少600转/分的转速进行步骤(c)和(e)的至少一者中的叶轮旋转一段时间，同时保持至少3×103s-1的剪切速率，任选地，其中步骤(c)至(e)重复多个循环。


20.权利要求19所述的方法，其中以至少600转/分的转速进行步骤(c)和(e)两者一段时间，同时保持至少3×103s-1的剪切速率。


21.权利要求17所述的方法，其中所述至少一种反应物选自：脱保护剂、偶联剂和被保护的单体有机分子。


22.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴姆·吉伦，摩西·本托里拉，
申请(专利权)人：耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL