一种人A组轮状病毒的RPA-LFD检测引物和探针、核酸试纸条检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，尤其涉及一种人A组轮状病毒的RPA‑LFD检测引物和探针、核酸试纸条检测试剂盒及应用。本发明专利技术针对人A组轮状病毒的VP6基因，建立并评估了基于RPA核酸试纸条检测试剂盒。RPA所需的引物长度为30‑35bp，探针序列的长度为46‑52bp。本发明专利技术采用RPA核酸检测试纸条建立可视化检测人A组轮状病毒的试剂盒，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为人A组轮状病毒的非诊断目的的现场检测提供了一种灵敏、可靠的新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种人A组轮状病毒的RPA-LFD检测引物和探针、核酸试纸条检测试剂盒及应用
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种人A组轮状病毒的RPA-LFD检测引物和探针、核酸试纸条检测试剂盒及应用。
技术介绍
轮状病毒是引起婴儿与幼儿腹泻的主要病原体之一，主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪-口途径，临床表为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，严重出现脱水和电解质紊乱症状，如不及时纠正，可导致死亡。根据1986-2000年轮状病毒性腹泻病例统计，全世界每年因轮状病毒感染导致的5岁以下低龄儿童腹泻病例约有1.11亿，约2500万例患儿需要寻医就诊，200万人需要住院治疗，其中死亡人数高达352,000-592,000人，且病患人数逐年增加。在我国轮状病毒感染的发病率高达30％-40％，这种现状不仅对我国婴幼儿的生活质量构成了严重的威胁，而且也对我们国家的医疗资源造成了巨大的损失。因此，对轮状病毒进行及时、准确的检测，对其预防控制和临床诊治至关重要。轮状病毒(Rotavirus，简称RV)是一种双链RNA病毒，属于呼肠孤病毒科，含有11个分阶段的基因片断，每个RNA片段各编码1种蛋白，包括6种结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5种非结构蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5)。根据其内层衣壳蛋白(viralprotein，VP)-6的组特异性抗原表位，轮状病毒可分为A～G共7组，其中A组最为常见，是造成婴幼儿急性重症性腹泻的主要病原，且感染超过90％的病例是由该组毒株引起。目前对人A组轮状病毒的快速诊断技术包括直接血凝技术、基因检测技术、酶联免疫技术等，但这些检测方法耗时并且准确性不高。如直接血凝技术主要从唾液、粪便等分泌物中检测轮状病毒，其结果不易重复，需要有经验的技术人员。基于抗原-抗体的酶联免疫吸附试验技术，是从识别病原相关蛋白对病原体进行免疫学检测的方法，可根据不同检测目的设计特异的包被抗体和标记抗体，但由于免疫学的方法灵敏度低，不能在发病早期就检测出轮状病毒，因此可能会导致误诊，增加病人的负担。PCR技术灵敏度高，可从痕量样品中检测出目标分子，这对医院和社区环境中的感染控制、预防、治疗很有意义；但其开展条件要求严格，需要精密昂贵的检测仪器、实验室环境及专业操作人员，并且耗时长，需要电泳判定结果，很难推广于基层卫生部门，尤其在农村及部队野外训练等条件艰苦地区，不利于轮状病毒的现场快速检测。因此，要实现人A组轮状病毒的感染监控，亟待建立一种特异性好，灵敏度高，方法简单，耗时短，能快速检测人A组轮状病毒的新检测技术。重组酶聚合酶扩增技术是一种新型恒温核酸扩增技术，其扩增原理是，重组酶与引物结合形成复合物后，寻找匹配的DNA同源序列，紧密结合发生重组，在单链DNA结合蛋白的作用下，模板DNA开始解链，引物与模板DNA配对，在BsuDNA聚合酶的作用下复制延伸，对目的片段进行指数级扩增(Forgetetal.,2012)。RPA整个过程仅需要在37-42℃等温条件下反应15-20分钟即可得到扩增产物，不需要高温变性和退火的过程，整个反应简单、快速、高效。RPA与侧流层析技术相结合(RPA-LFD)，可以在水浴锅或者直接用人体温进行加热，将温度控制在37-42℃之间，随后可直接通过侧向流动层析试纸条读取实验结果。在整个反应体系中，需要生物素标记的反向引物和羧基荧光素(FAM)标记的特异探针，该探针在距羧基荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被大肠杆菌核酸外切酶nfo进行识别并切割，产生自由的羟基末端，然后便在DNA聚合酶的作用下延伸，形成具有生物素和羧基荧光基团双标记的RPA产物。将其滴加于试纸条上便会与胶体金标记的抗FAM的抗体结合，形成三元复合物，通过层析膜扩散，被生物素配体捕获，形成具有颜色的检测线。RPA-LFD检测体系操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强，可在常温下反应，可用肉眼直接观察结果，能脱离对电力、仪器及专业实验人员的依赖，非常适于基层卫生部门应用，尤其是现场及野外环境。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种人A组轮状病毒的RPA-LFD检测引物和探针、核酸试纸条检测试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本专利技术提供的用于检测人A组轮状病毒的RPA核酸试纸条试剂盒，具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作方法简单等优点。本专利技术是这样实现的，一种人A组轮状病毒的RPA-LFD检测引物和探针，所述引物的序列见SEQIDNO.7和SEQIDNO.11所示，所述探针的序列见SEQIDNO.14所示。本专利技术还披露了一种人A组轮状病毒的RPA核酸试纸条检测试剂盒，包括如上述的引物和探针序列，还包括通用型核酸检测试纸条，下游引物SEQIDNO.11的3’端修饰生物素基团Biotin；探针SEQIDNO.14的5’端修饰5-羧基荧光素基团FAM，中间修饰四氢呋喃THF，3’端修饰C3spacer。进一步地，还包括重组酶等温扩增试剂盒，所述重组酶等温扩增试剂盒包括重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液RehydrationBuffer、280mM醋酸镁溶液和去离子水。本专利技术还披露了如上述的人A组轮状病毒的RPA-LFD检测引物和探针在非诊断目的的人A组轮状病毒检测中的应用。本专利技术还披露了如上述的人A组轮状病毒的RPA核酸试纸条检测试剂盒在非诊断目的的A组轮状病毒检测中的应用。进一步地，所述应用的方法包括以下步骤：(1)配置RPA反应体系，在装有RPA冻干酶粉的TwistAmpnfoKit反应管中加入29.5μLRehydrationBuffer，2.1μL10μM上游引物，2.1μL10μM下游引物，0.6μL10μM探针，9.2μL双蒸水，4μL病毒DNA模板，在反应管盖上加280mM醋酸镁溶液2.5μL，上下颠倒反应管使之充分混匀后离心；37-42℃恒温反应8-25min；(2)检测：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，2-5min观察结果；(3)结果判读：①阴性：仅在质控区一条蓝色条带，在检测区内无红色条带出现，证明所检测的样本没有A组轮状病毒感染；②阳性：出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明所检测的样本为A组轮状病毒病毒感染；③无效：质控区和检测区内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。进一步地，步骤(1)中恒温反应条件为37℃反应10min。结束后通过侧向流动层析试纸条对结果进行检测。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术针对人A组轮状病毒的VP6基因，建立并评估了基于RPA核酸试纸条检测试剂盒。RPA所需的引物长度为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp。(1)本专利技术采用RPA核酸检测试纸条建立可视化检测人A组轮状病毒的试剂盒，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人A组轮状病毒的RPA-LFD检测引物和探针，其特征在于：所述引物的序列见SEQID NO.7和SEQ ID NO.11所示，所述探针的序列见SEQ ID NO.14所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种人A组轮状病毒的RPA-LFD检测引物和探针，其特征在于：所述引物的序列见SEQIDNO.7和SEQIDNO.11所示，所述探针的序列见SEQIDNO.14所示。


2.一种人A组轮状病毒的RPA核酸试纸条检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1中所述的引物和探针序列，还包括通用型核酸检测试纸条，下游引物SEQIDNO.11的3’端修饰生物素基团Biotin；探针SEQIDNO.14的5’端修饰5-羧基荧光素基团FAM，中间修饰四氢呋喃THF，3’端修饰C3spacer。


3.根据权利要求2所述的一种人A组轮状病毒的RPA核酸试纸条检测试剂盒，其特征在于，还包括重组酶等温扩增试剂盒，所述重组酶等温扩增试剂盒包括重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液RehydrationBuffer、280mM醋酸镁溶液和去离子水。


4.如权利要求1所述的人A组轮状病毒的RPA-LFD检测引物和探针在非诊断目的的人A组轮状病毒检测中的应用。


5.如权利要求2或3所述的人A组轮状病毒的RPA核酸试纸条检测试剂盒在非诊断目的的A组...

【专利技术属性】
技术研发人员：高恶斌，詹诸明，
申请(专利权)人：上海予泉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31