一种生物合成对豆香酸的工程蓝细菌及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种生物合成对豆香酸的工程蓝细菌及其制备方法，生物合成对豆香酸的载体包含在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的苯丙氨酸酶基因和肉桂酸

【技术实现步骤摘要】
一种生物合成对豆香酸的工程蓝细菌及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种生物合成对豆香酸的工程蓝细菌及其制备方法。

技术介绍

[0002]目前，对豆香酸(p
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coumaric acid)，又称为“4
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羟基肉桂酸”，是自然界植物体内广泛存在的天然产物之一。对豆香酸主要存在于水果、蔬菜、谷物和真菌，尤其在中草药中含量很丰富。对豆香酸作为苯丙素类物质、芪类物质及黄酮类物质的重要前体化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗血小板聚集、保护心血管、预防和改善糖尿病及神经保护作用等对人体有益的生物活性，在生物医药、化妆品及食品工业中均有广泛的应用价值。另外，对香豆酸是植物苯丙氨酸次级代谢途径的中间产物，是合成类黄酮、异黄酮、芪类等高价值保健营养品的中间体，如杜鹃素、柚皮素、花青素、槲皮素、儿茶素和白藜芦醇等。而且它还是一种重要的有机化工原料，广泛应用于药物、香精香料等精细化工产品的制备。目前，对香豆酸的主要来源为植物提取、化学合成和生物合成。植物提取面临生长周期长、收益率低及受环境影响大等问题，而化学合成则面临高能耗、低产率及污染环境等问题。通过生物技术的方法，实现微生物发酵合成植物天然产物对豆香酸，可有效降低成本，具有高产率和绿色环保等优点，是21世纪最有前途的生产方法。
[0003]蓝细菌，即蓝藻(Cyanobacteria)，是一种可进行光合作用的原核生物，又称为蓝绿藻或蓝细菌。蓝藻结构简单，没有成形细胞核，也没有高等植物所具有的叶绿体等细胞器，其光合作用在类囊体膜上进行。蓝藻是地球上出现时间最早的藻类，它孕育了一切好氧生物的产生。蓝藻作为一种原核生物，其可以同高等植物一样进行光合作用，许多科学家将蓝藻看作一种“光合反应器”，蓝藻通过固定CO2即可生物合成大量的人类所需的化工产品和天然植物产物。对蓝藻进行基因改造以进行生物合成具有许多优势，如细胞结构简单、易于基因操作、生长速度较快、不受气候和土地限制等。重要的是，蓝藻具有较高的太阳能利用效率，比大多数微生物的营养需求低，仅需要太阳能、水、CO2、N和P等无机营养，不依赖于有机碳源。此外，蓝藻在生产植物天然产物方面有着许多与生俱来的独特优势。在植物天然产物的合成过程中，涉及到许多植物酶，其中细胞色素P450单加氧酶对苯丙烷类、生物碱类和萜类等天然产物的合成至关重要。然而，许多真核生物的P450单加氧酶都是膜结合蛋白，难以在大肠杆菌等大多数原核微生物中异源表达，因为这类微生物缺少内生的膜系统。蓝藻与大多数原核微生物不同，其细胞内拥有类囊体膜系统，使得植物源P450单加氧酶可以功能性的表达。因此，这些诸多优势使得蓝细菌成为植物天然产物光合生产的立项平台，具有美好的前景和广泛的应用价值。
[0004]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有对香豆酸的主要来源为植物提取、化学合成和生物合成，植物提取面临生长周期长、收益率低及受环境影响大等问题，而化学合成则面临高能耗、低产率及污染环境等问题。
[0005]解决以上问题及缺陷的难度为：利用蓝藻合成植物天然产物，还需要进一步研究
植物源酶适配性、还原力及能量供应、蓝藻光合效率的优化以及合成产物的外排等方面。
[0006]解决以上问题及缺陷的意义为：利用光合蓝藻进行植物天然产物合成，不仅可以更加高效地合成价值高昂的植物天然产物，而且减少植物种植面积有限、生长慢、化合物含量低和分子类似物多等限制，为人类很好地开发利用植物天然产物并走向大规模工业化应用提供技术保障。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种生物合成对豆香酸的工程蓝细菌及其制备方法。
[0008]本专利技术是这样实现的，一种生物合成对豆香酸的工程蓝细菌，所述生物合成对豆香酸的工程蓝细菌为蓝细菌集胞藻Synechocystis sp.PCC6803菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.5882、CGMCC NO.5883或CGMCC NO.5884。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供一种生物合成对豆香酸的载体，所述生物合成对豆香酸的载体，基于蓝细菌集胞藻Synechocystis sp.PCC6803菌株，包含在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的苯丙氨酸酶基因和肉桂酸
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羟化酶基因；
[0010]所述苯丙氨酸酶基因DNA序列为SEQ ID NO：1所示的序列；所述肉桂酸
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羟化酶基因DNA序列为SEQ ID NO：2所示的序列。
[0011]进一步，所述载体在两端分别具有蓝细菌基因的上游片段和下游片段，通过同源重组将苯丙氨酸酶基因和肉桂酸
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羟化酶基因整合入蓝细菌基因组中所述蓝细菌基因所在的位置；所述上游片段基因DNA序列为SEQ ID NO:3，所述下游片段基因DNA序列为SEQ ID NO:4。
[0012]本专利技术的另一目的在于提供一种所述生物合成对豆香酸的载体编码的蛋白，所述蛋白包括：苯丙氨酸酶基因编码的具有苯丙氨酸酶活性的蛋白质，以及肉桂酸
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羟化酶基因编码具有肉桂酸
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羟化酶活性的蛋白质；
[0013]所述PAL基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者所述PAL基因编码SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；
[0014]所述C4H基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者所述C4H基因编码SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
[0015]本专利技术的另一目的在于提供一种用于检测对豆香酸的试剂盒，所述用于检测对豆香酸的试剂盒包含所述的生物合成对豆香酸的载体。
[0016]本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述的生物合成对豆香酸的载体的生物合成对豆香酸的第一载体，所述生物合成对豆香酸的第一载体为蓝细菌基因slr0168构建的第一载体；
[0017]所述述slr0168基因(参见NCBI登录号BAA10047.1)是集胞藻PCC6803基因组中编码一个未知功能蛋白的基因，前人的研究证明该基因的缺失对于细胞的生理活性没有影响，所以该基因所在的位置被认为是集胞藻PCC6803基因组中的一个中性位点；
[0018]slr0168基因的上游片段具有SEQ ID NO：3所示的序列以及所述slr0168基因的下游片段具有SEQ ID NO：4所示的序列；
[0019]所述第一载体包含的启动子是铜离子诱导型启动子，若所述启动子是PpetE启动子，具有SEQ ID NO：5所示的序列；
[0020]所述第一载体还包含用于筛选蓝细菌转化体的标记基因，若选自壮观霉素抗性基因，则具有SEQ ID NO：8所示的序列。
[0021]本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述的生物合成对豆香酸的载体的生物合成对豆香酸的第二载体，所述生物合成对豆香酸的第二载体为：蓝细菌slr2081基因构建第二载体；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物合成对豆香酸的载体，其特征在于，所述生物合成对豆香酸的载体，基于蓝细菌集胞藻Synechocystis sp.PCC6803菌株，包含在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的苯丙氨酸酶基因和肉桂酸
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羟化酶基因；所述苯丙氨酸酶基因DNA序列为SEQ ID NO：1所示的序列；所述肉桂酸
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羟化酶基因DNA序列为SEQ ID NO：2所示的序列。2.如权利要求1所述的生物合成对豆香酸的载体，其特征在于，所述载体在两端分别具有蓝细菌基因的上游片段和下游片段，通过同源重组将苯丙氨酸酶基因和肉桂酸
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羟化酶基因整合入蓝细菌基因组中所述蓝细菌基因所在的位置；所述上游片段基因DNA序列为SEQ ID NO:3，所述下游片段基因DNA序列为SEQ ID NO:4。3.一种如权利要求1
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2任意一项所述生物合成对豆香酸的载体编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白包括：苯丙氨酸酶基因编码的具有苯丙氨酸酶活性的蛋白质，以及肉桂酸
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羟化酶基因编码具有肉桂酸
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羟化酶活性的蛋白质；所述PAL基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者所述PAL基因编码SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；所述C4H基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者所述C4H基因编码SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。4.一种用于检测对豆香酸的试剂盒，其特征在于，所述用于检测对豆香酸的试剂盒包含权利要求1～2任意一项所述的生物合成对豆香酸的载体。5.一种应用如权利要求1～2任意一项所述的生物合成对豆香酸的载体的生物合成对豆香酸的第一载体，其特征在于，所述生物合成对豆香酸的第一载体为蓝细菌基因slr0168构建的第一载体；slr0168基因的上游片段具有SEQ ID NO：3所示的序列以及所述slr0168基因的下游片段具有SEQ ID NO：4所示的序列；所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：高恶斌，詹诸明，
申请(专利权)人：上海予泉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：