【技术实现步骤摘要】
一种通用质粒及其构建方法和集胞藻表达外源基因的新方法
[0001]本专利技术涉及一种利用Kana抗性基因启动子启动目的基因在集胞藻PCC 6803中表达的通用质粒及其构建方法，并且公开了一种利用此质粒在集胞藻中表达外源基因的新方法，属于基因工程领域。
技术介绍
[0002]质粒是是闭合环状的双链DNA分子，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。质粒构建技术是基因工程常用的技术之一。质粒在有些菌株细胞内可以随宿主基因组一起复制，但在有些菌中如蓝细菌，质粒只是一种载体将目的基因导入藻细胞，随后需要通...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种利用Kana抗性基因启动子启动目的基因在集胞藻PCC 6803中串联表达的通用质粒，以及利用此质粒构建的表达纤维素外切酶的基因工程藻。2.如权利要求1所述的通用质粒，其特征在于，可在大肠杆菌与集胞藻PCC 6803中穿梭表达。利用集胞藻PCC6803的psbA2基因起始密码子ATG前510bp片段作为同源重组载体启动子兼做上游臂，以psbA2基因ORF片段为下游臂，可将目的基因与Kana抗性基因导入到集胞藻PCC 6803并整合到基因组中，在Kana抗性基因与终止子之间插入目的基因，利用Kana抗性基因启动子启动Kana抗性和目的基因在集胞藻内的串联表达，得到可在大肠杆菌与集胞藻PCC6803中穿梭表达，利用Kana抗性基因启动子启动目的基因表达的通用质粒载体P5ST1T2Kana，实现外源基因在集胞藻中的表达。3.如权利要求1所述的通用质粒，其构建步骤如下：(1)质粒构建以质粒P5ST1T2-downstream为基础，用限制性内切酶BamHI处理puc4K质粒回收获得Kana抗性序列，序列如序列表中SEQ ID NO：14所示；(2)以序列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为上下游引物，以步骤(1)回收所得的序列为模板，通过PCR扩增技术获得Kana启动子与Kana抗性基因序列：Promote-Kana，通过引物在Promote-Kana上下游两端分别添加酶切位点BamHI与NheI，获得序列如序列表中SEQ ID NO：15所示；(3)以序列表中SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为上下游引物，以步骤2回收所得的序列为模板，通过PCR扩增技术获得Kana终止子基因序列：terminator，通过引物在terminator上下游两端分别添加酶切位点NheI与BamHI，获得序列如序列表中SEQ ID NO：16所示；(4)用限制性内切酶BamHI处理质粒载体PUC18，将步骤(2)与步骤(3)所获得的序列在重组酶的作用下连接至酶切纯化回收所得的PUC18质粒中，得到T载质粒puc18-Kana；(5)，用限制性内切酶BamHI处理质粒载体P5ST1T2-downstream与T载质粒puc18-Kana，将酶切T载质粒puc18-Kana所获得的Pro-Kana-NheI-terminator片段在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，制得可穿梭表达的通用质粒载体命名为P5ST1T2Kana。4.如权利要求1所述的通用质粒，其特征在于，所述步骤(2)中，扩增引物核苷酸序列如下：Pro-Kana-F：5
’-
CAGGTCGACTCTAGAGGATCCCAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG-3
’
；Pro-Kana-R：5
’-
CCAATTCTGAGGCTAGCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTG-3
...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴玉杰，宁玉林，吕和鑫，张黎明，满淑丽，贾士儒，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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