用于乳酸生产的微生物和工艺制造技术

公开了用于生产D‑乳酸和L‑乳酸的改进的酵母菌株和发酵工艺。改进导致更高的滴度、更高的产率、更短的时间、更低的pH和更高的平均比生产率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于乳酸生产的微生物和工艺相关申请的交叉引用本申请要求于2018年2月16日提交的美国临时申请系列号62/631,541的优先权。
本专利技术涉及用于化学生产的微生物的基因工程的领域。更具体地，本专利技术涉及使用基因修饰的酵母，由可再生碳资源生产乳酸。
技术介绍
当前使用的许多塑料和纤维在自然环境中难以堆肥；例如，衍生自聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酯和尼龙的塑料和纤维在自然环境中保留很长的时间。为了长期环境管理工作的目的，期望用衍生自在自然环境中易于堆肥的生物可再生资源的聚合物替代传统的塑料和纤维。此外，随着世界上开采的石油的供应变得更加稀少并且获得起来更昂贵，期望用生物可再生单体替代石油化学单体。乳酸的聚合物一般在自然环境中可堆肥。乳酸(2-羟基丙酸)作为两种立体异构体之一存在：L-乳酸，也称为L(+)-乳酸或S-乳酸(L-LAC)，或D-乳酸，也称为D(-)-乳酸或R-乳酸(D-LAC)。两种异构体可通过发酵由生物可再生资源(比如糖)制备。目前通过发酵生产的大部分乳酸为L-LAC。聚-L-乳酸(PLLA)为生物可降解的并且制备用于一些应用的塑料；然而，其相对低的约180℃的熔化温度限制了其有用性(Tsuji，2005)。然而，通过将等重量的PLLA和聚-D-乳酸(PDLA)熔化在一起，可将PLLA的熔化温度升高约45℃达到约225℃，产生本文中所谓的“立构复合PLA”(Tsuji，2005)。将熔化温度升高至高于水的沸点对于许多应用是重要的，比如用于热饮的杯子、塑料餐具和可在热的温度下洗涤和熨烫或压制的织物。最重要地，立构复合PLA的较高的熔化温度对于生产高质量“压裂珠”是必要的，该“压裂珠”被泵入深层气藏和油藏中的裂隙岩层，目的是使裂缝保持足够打开以提取、移除或泵出期望的天然气或油。乳酸可从游离酸或丙交酯开始聚合。丙交酯为乳酸的环二酯，并且可由两个L-LAC分子组成(L,L-丙交酯)、两个D-LAC分子组成(D,D-丙交酯)或L-LAC和D-LAC各一个分子组成(D,L-丙交酯或内消旋丙交酯)。将L-乳酸和D-乳酸单体的混合物，或丙交酯(L,L-丙交酯、D,D-丙交酯和D,L-丙交酯)的混合物聚合不导致具有期望的较高熔化温度的聚合物(Tsuji，2005)。而是，为了获得具有较高熔化温度的期望的聚合物，必须分别制备高度纯的L-LAC的高分子量聚合物和高度纯的D-乳酸的高分子量聚合物，并且仅在聚合之后混合。因此，为了制备期望的和有用的立构复合PLA，起始材料必须为纯手性的L-LAC和纯手性的D-LAC。有时将纯的异构体称为“光学纯的”。如本文使用的“光学纯的”或“纯手性的”意为乳酸为按重量百分数计或摩尔百分数计大于99％的一种异构体。可通过任何一种众所周知的方法确定光学纯度，例如使用填有介质的柱的分析高压液相色谱(HPLC)，该介质本身在其表面上携带光学纯的手性组分，例如，填有D-青霉胺包被的珠的Phenomenex(Torrance，美国加利福尼亚州)Chirex3126柱(250X4.60mm)。流动相为具有1ml/分钟的流速的1mM硫酸铜水溶液并且在254nm处UV检测。可替换的方法使用ShodexTMORpakCRX-853(8.0mmI.D.x50mm)柱(ShowaDenko，日本东京)，用0.5mMCuSO4水溶液洗脱，流速1.0mL/分钟，用230nm的UV检测，并且柱温度为50℃(根据制造商推荐)。如果在特定的上下文中未指定乳酸的异构体，则术语“乳酸”或“乳酸盐”指任一种或两种异构体，或两者的混合物。通过非生物化学合成生产的乳酸为等份的L-LAC和D-LAC的外消旋混合物，所以其不能用于制备立构复合PLA。历史上，如果通过用微生物发酵来生物生产，则大部分大规模制造的乳酸为L-LAC，或如果化学(即，非生物)生产，则为L-LAC和D-LAC的外消旋混合物。开发了通过大肠杆菌(Escherichiacoli)的基因工程改造的菌株生产高度纯的手性D-LAC的工艺(Zhou等，2003)。然而，因为大肠杆菌只能在中性pH下良好生长，所以D-LAC必须作为盐(例如与铵、钠、钾、钙或镁阳离子一起)生产，并且然后必须将质子化的游离酸与阳离子分离，以实现聚合，这增加了工艺的显著的成本。截至2017年11月28日，可从Corbion(荷兰，阿姆斯特丹)的Purac部门购买通过未公开的工艺生产的D-LAC。然而，D-LAC的购买价格显著高于L-LAC的购买价格。由于纯的D-LAC的高价格，立构复合PLA尚未被大规模商业生产商广泛采用。美国专利申请公开号US2015/0152449公开了用于由L-LAC或L-LAC和D-LAC的外消旋混合物生产D-LAC的化学工艺。该工艺涉及首先通过加热L-LAC制备外消旋混合物。然后将外消旋丙交酯混合物溶于正丁醇和丙酮中，并且经过固定化的Novozyme435(MilliporeSigma，美国密苏里州圣路易斯)的柱，该Novozyme435为对于酯形成具有立体特异性的脂肪酶。产物为D-乳酸的1-丁醇酯和L,L-乳酸基乳酸的1-丁醇酯(二聚体)的50-50混合物。然后可将这两种化学品通过蒸馏分离并且大概水解以得到游离酸、丙交酯和/或聚合物，但是该美国专利申请公开未公开如何完成该最后一个步骤。来自酶工艺和蒸馏工艺的产率和纯度不是完美的。在一个示例中，在固定化酶上运行8次每次7小时之后，乳酸D-丁酯的产率从92％下降至79％。在通过蒸馏分离两种酯的一个示例中，“分析的蒸馏产物为93.9％的乳酸(R)-丁酯；0.4％的乳酸(S)-丁酯、5.0％的丁醇；0.5％的(S,S)-丁基乳酸基乳酸酯；0.1％的(R,R)-丁基乳酸基乳酸酯和0.1％的(R,R)-丙交酯。”如此，乳酸酯部分含有约99％的D-LAC和约1％的L-LAC。该美国专利申请公开中未显示该水平的纯度是否足够制备高质量的立构复合PLA。无论如何，该美国专利申请公开中公开的工艺是相当复杂的，需要若干单元操作(除了发酵和下游纯化之外)、可能具有有限寿命的昂贵酶以及防爆器材，并且因此可能比用于生产纯的形式的异构化形式的乳酸的简单发酵工艺更昂贵。因此，仍需要生产光学纯的D-LAC的工艺，以便鼓励更宽泛地采用立构复合PLA作为经济上有吸引力的可堆肥的塑料。降低生产D-LAC的成本的一种途径是使用酵母作为生产生物体。与大部分细菌相比，在相对低的pH下，许多酵母菌株可良好生长，所以能够在其pKa或低于其pKa(其pKa公开为pH3.86)的pH下通过发酵生产D-LAC或L-LAC。在pH3.86下，与pH7发酵相比，只需要约一半多的阳离子，使得分离阳离子的下游工艺将相应地较便宜。如果生产发酵罐中的最终pH可甚至低于3.86，则生产成本可甚至进一步降低。在通过酵母生产L-乳酸的领域，存在很多现有技术，但是在D-乳酸生产的领域，存在很少的现有技术(见Sauer等，2010年综述)。Zhou等公开了通过天然产生D-LAC的基因工程改造的大肠杆菌增加D-LAC的生产，其中删除了竞争厌氧途径，并且应用代谢进化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种被基因工程改造以生产乳酸的酵母菌株，所述酵母菌株包括编码外源乳酸脱氢酶的染色体整合的基因，其中所述酵母菌株在发酵生产培养基中以至少1.875g/L-hr的平均比生产率生产乳酸，并且其中所述发酵生产培养基具有低于3.86的最终pH。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180216 US 62/631,5411.一种被基因工程改造以生产乳酸的酵母菌株，所述酵母菌株包括编码外源乳酸脱氢酶的染色体整合的基因，其中所述酵母菌株在发酵生产培养基中以至少1.875g/L-hr的平均比生产率生产乳酸，并且其中所述发酵生产培养基具有低于3.86的最终pH。


2.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株在发酵生产培养基中以至少3.00g/L-hr的平均比生产率生产乳酸。


3.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株在发酵生产培养基中以至少3.00g/L-hr的平均比生产率和小于1g/L的最终丙酮酸滴度生产乳酸。


4.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株选自由下述属组成的组：酵母属、克鲁维酵母属、伊萨酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、接合酵母属、裂殖酵母属、耶罗威亚酵母属和Lachancea。


5.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株选自由下述属组成的组：酵母属和克鲁维酵母属。


6.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中编码外源乳酸脱氢酶的所述基因在选自由下述组成的组中的至少一个染色体基因座处整合：丙酮酸脱羧酶基因或其同源物或类似物、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因或其同源物或类似物、甘油-3-磷酸磷酸酶基因或其同源物或类似物，以及NADH脱氢酶1基因或其同源物或类似物。


7.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中编码外源乳酸脱氢酶的所述基因在丙酮酸脱羧酶基因或其同源物或类似物、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因或其同源物或类似物、甘油-3-磷酸磷酸酶基因或其同源物或类似物以及NADH脱氢酶1基因或其同源物或类似物的基因座处整合。


8.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株对乳酸类似物具有抗性。


9.根据权利要求8所述的酵母菌株，其中所述乳酸类似物选自由下述组成的组：3-氯乳酸盐(β-氯乳酸盐)、3,3-二氯乳酸、3,3,3-三氯乳酸、3-氟乳酸、3...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏丹舒·维贾伊·多莱，泰龙·赫尔曼，肖恩·约瑟夫·勒冈，马克·安德鲁·谢夫，拉塞尔·利萨尔多·乌代尼，R·罗杰斯·约卡姆，
申请(专利权)人：PTT全球化学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：泰国;TH