本发明专利技术公开了能够由选自葡萄糖、果糖、蔗糖或其混合物的碳源生产乳酸的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中基因工程酵母包括至少一个异源DNA盒，所述至少一个异源DNA盒使得产生作为果糖输入子的蛋白。根据本发明专利技术的基因工程酵母菌株相比常规菌株具有改善的果糖利用并且以更快的速率使用果糖，从而允许更短的发酵时间和改善的经济性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改善糖果利用的工程微生物菌株相关申请的交叉引用不适用关于联邦资助的研究或开发的声明不适用联合研究协议不适用序列表的参考序列表通过引用并入本文。
本专利技术涉及用于化学生产的微生物的基因工程领域。更具体地，本专利技术涉及使用选自葡萄糖、果糖、蔗糖或其混合物的碳源，使用基因修饰的微生物生产乳酸。
技术介绍
本专利技术人和他人已经工程化改造了马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)菌株以生产D-乳酸或L-乳酸(对于两个代表性示例，见美国临时专利申请62/631,541和US7,534,597)。在除了美国专利申请62/631,541之外的所有现有技术示例中，在生物发酵中都使用右旋糖作为碳源。然而，在泰国和东南亚以及其他温带或热带地区(比如，巴西、中美、印度、美国南方等)，用于生物发酵的优选碳源是来自甘蔗汁的二糖蔗糖。类似地，在制糖用甜菜生长的温带地区，蔗糖可为用于生物发酵的优选碳源。马克斯克鲁维酵母，以及许多其他酵母，比如酿酒酵母，将转化酶分泌到发酵培养基或周质空间中，该酶将蔗糖切割成两种单糖，D-葡萄糖(D-葡萄糖，也称为右旋糖，为简洁起见，在下文中将简称为葡萄糖)和D-果糖(为简洁起见，在下文中将简称为果糖)。然后将两种单糖输入酵母细胞并且代谢。大多数微生物，包括刚刚提及的两种酵母物种，当与葡萄糖和任何其他碳源(比如，果糖)的混合物一起存在时，优选代谢葡萄糖。这种优选通常通过压制或抑制非葡萄糖碳源的利用来实现，所述压制或抑制非葡萄糖碳源的利用是通过给出了多种名称的几种不同机制中的任一种，比如葡萄糖抑制、葡萄糖压制、分解代谢物抑制、碳分解代谢物抑制和诱导物排除。我们注意到，在使用我们的生产D-乳酸或L-乳酸的菌株之一和蔗糖作为碳源的大多数发酵中，在发酵结束时，通常为约48小时通常在发酵液中残留一些果糖(见，图17)。果糖浓度典型地从约1g/L至约20g/L变化，而葡萄糖浓度通常低于检测限。这种模式证明了平均而言果糖比葡萄糖利用更慢，因为蔗糖的切割产生了等摩尔量的葡萄糖和果糖。不希望残留果糖的存在，因为它是一种还原糖并且因此可以在“美拉德反应(MaillardReactions)”和/或焦糖化反应中与氨基化合物反应，从而产生不希望的黄色和棕色化合物，这些化合物难以在乳酸的下游处理中除去。此外，残留果糖为废碳的形式，因为将其从废物流中回收是不切实际的。如果能够以更快的速率利用果糖，就可从蔗糖获得更高产率的产物。因此，出于以下两个良好的原因，改善的果糖利用将是有用的，1)减少不期望的副产物，以及2)获得更高产率的期望产物。在生产D-乳酸或L-乳酸的马克斯克鲁维酵母发酵中通常看到残留果糖，然后我们显示了，当酿酒酵母酿酒菌株在用于乙醇生产的蔗糖或葡萄糖和果糖的混合物上生长时，会发生相同的现象。在葡萄糖已经完全消耗时，我们发现了残留的果糖。对于一些商业细菌发酵，蔗糖仍为优选的碳源，并且发生类似的问题，即，在葡萄糖被消耗之后在发酵液中保留了残留的果糖(例如，见US9,845,513中的图1)。我们将使用短语“果糖问题”或“该果糖问题”来意指下面的现象，其中微生物菌株平均而言以比其消耗果糖更快的速率消耗葡萄糖，或在生长或发酵过程中的某一阶段在包含葡萄糖和果糖的培养基中的生长或发酵过程中的任何其他时间以比其消耗果糖更快的速率消耗葡萄糖。葡萄糖和果糖的混合物可以在生长或发酵开始时存在于培养基中，或所述混合物可在生长或发酵过程中通过蔗糖的水解产生。因此，由于上述葡萄糖对果糖利用的抑制，当许多微生物物种在作为碳源的蔗糖上生长时，所得葡萄糖比所得果糖消耗得更快，这使得使用蔗糖或含有葡萄糖和果糖的混合物进行的商业发酵，需要比仅使用葡萄糖的发酵进行更长的时间，以使所有的糖都被消耗并且转化为希望的产物，比如乙醇、一种或多种丁醇异构体、D-乳酸、L-乳酸、琥珀酸，苹果酸、柠檬酸、类胡萝卜素、异戊二烯、脂质或任何其他具有商业上感兴趣的化学品。本专利技术的目的是通过任何合适的或期望的微生物菌株增加果糖利用速率，所述微生物菌株用于从选自葡萄糖、果糖、蔗糖或其混合物的碳源的发酵。现有技术专利技术人不知道出于改进果糖利用的目的的商业酵母菌株的任何工程化。在巴西简单运行使用甘蔗汁和糖蜜以及常规酵母菌株进行乙醇发酵直到已经消耗了所有糖。认为在Cargill和BioAmber的商业L-乳酸和琥珀酸发酵使用基于葡萄糖的工程化的东方伊萨酵母酵母(Issatchekiaorientalis)作为唯一碳源，因为亲本菌株不使用蔗糖。Cargill已经提交了美国专利申请，其描述了向它们的东方伊萨酵母酵母琥珀酸生产者中加入转化酶基因，但是所得菌株明显具有如以上定义的“果糖问题”(见WO2017/091610A1的图1)。WO2017/091610A1还公开了通过产生转化酶的酵母生产“乳酸”的概念。然而，WO2017/091610A1没有区分D-乳酸与L-乳酸并且没有公开如何工程化酵母菌株以使用蔗糖或包含葡萄糖和果糖的混合物经济地生产D-乳酸或L-乳酸，或如何在经济上有吸引力的方法中，使用蔗糖或包含葡萄糖和果糖的混合物，通过这种酵母生产D-乳酸或L-乳酸。此外，WO2017/091610A1忽略了公开由酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)的工程化菌株生产L-乳酸的现有技术，其中编码丙酮酸脱羧酶的一个或多个基因已经被缺失并且天然地分泌转化酶(US7,049,108B2)。虽然US7,049,108B2公开了生产L-乳酸或D-乳酸的概念，但是公开的菌株和方法再一次现在允许经济上有吸引力的方法，该发可与当前的商业方法竞争，例如使用细菌如凝结芽孢杆菌作为生产生物的那些方法(Poudel，2016#124)；Michelson，2006#123)。用于生产乳酸的异构体的“经济上有吸引力的”方法是一种由酵母菌株进行的方法，该酵母菌株能够从蔗糖和/或葡萄糖和果糖的混合物以至少110g/L的滴度生产D-乳酸或L-乳酸，终pH小于3.7，在48小时或更短时间内，糖的产率为至少0.75g/g。US2011/0256598提出了来自大肠杆菌的岩藻糖：H+同向转运蛋白，用于增加微生物中果糖的输入，但是专利技术人没有表明这种输入子在酵母中的用途，所以不清楚它在酵母中是否起作用。(Pina，2004#121)描述了从拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)克隆编码果糖转运体的基因，该基因被指定为FFZ1(果糖促进接合酵母)。显示转运蛋白在酿酒酵母中起作用。然而，作者没有提及在蔗糖或葡萄糖和果糖的混合物上的生长，或在葡萄糖存在下改善的果糖利用。(Zhou，2017#1)还表明了由来自甘蓝假丝酵母(Candidamagnoliae)的“ffziI”或“fsy1”编码的果糖输入子在酿酒酵母(S.cerevisiae)中的功能，并且提出了它们用于在设计为从棉子糖生产蜜二糖的菌株中帮助消耗果糖的用途，但是本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其能够由选自葡萄糖、果糖、蔗糖或其混合物的碳源生产乳酸，其中所述基因工程酵母包括至少一个异源DNA盒，所述至少一个异源DNA盒使得产生用作果糖输入子的蛋白。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181221 US 62/783,6611.一种基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其能够由选自葡萄糖、果糖、蔗糖或其混合物的碳源生产乳酸，其中所述基因工程酵母包括至少一个异源DNA盒，所述至少一个异源DNA盒使得产生用作果糖输入子的蛋白。
2.根据权利要求1所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述果糖输入子通过促进扩散起作用。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述果糖输入子由外源FFZ1基因或其功能同源物编码。
4.根据前述权利要求所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述基因工程酵母菌株与亲本相比具有改善的果糖利用。
5.根据前述权利要求所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述基因工程酵母菌株能够消耗所有可测量的葡萄糖和果糖，果糖消耗速率为至少1.25g/L/小时。
6.根据前述权利要求所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中所述基因工程酵母菌株进一步包括盒，所述盒使得表达编码果糖激酶或己糖激酶的基因。
7.根据前述权利要求所述的基因工程克鲁维酵母属酵母菌株，其中克鲁维酵母属酵母菌株选自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏丹舒·维贾伊·多莱，乔尔·斯图尔特·施密特，R·罗杰斯·约卡姆，泰龙·赫尔曼，拉塞尔·利萨尔多·乌代尼，肖恩·约瑟夫·勒冈，马克·安德鲁·谢夫，米歇尔·思朋斯，莱恩·西勒斯，帕特哈农·巴实乔克，纳特哈武·鹏西拉，
申请(专利权)人：PTT全球化学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：泰国;TH
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