具有稳定的功能DNA序列的拷贝数的微生物及相关方法技术

本发明专利技术提供了用于鉴定和追踪可发生在经典菌株的开发期间或通过特定的遗传操纵最初构建用于生产生化物质的微生物菌株的代谢进化期间的基因组重复的方法、使用适当的可选择的标记使期望的基因组重复稳定化的拷贝数的方法，和具有稳定的功能DNA序列的拷贝数的非天然存在的微生物。

Microorganisms with stable copy numbers of functional DNA sequences and related methods

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有稳定的功能DNA序列的拷贝数的微生物及相关方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年6月30日提交的美国临时专利申请第62/527,442号和2017年11月10日提交的美国临时专利申请第62/584,270号的优先权。关于联邦政府赞助的研究或开发的声明不适用。联合研究协议不适用。参考序列表与本申请相关的序列表通过引用以其整体并入本文。含有序列表的文本文件通过USPTO电子归档系统(EFS-Web)电子提交。
本专利技术涉及通过微生物的发酵产生化学品的领域。更具体地，本专利技术涉及通过增加期望的化学品(也称为“发酵产物”)的滴度来改善通过发酵产生化学品的方法的经济性。甚至更具体地，可以通过创建、发现和遗传稳定化增加期望的化学品的滴度的染色体DNA序列重复来增加滴度。一旦鉴定，有益的复制可与其他有益的遗传性状结合。可对微生物(比如真细菌、酵母、丝状真菌和古细菌)进行基因工程改造，使其进化以产生有用的化学品，例如有机酸、醇、聚合物、氨基酸、胺、类胡萝卜素、脂肪酸、酯和蛋白质。在许多情况下，可通过基因工程和/或经典遗传学来构建生产有机体，使得期望的化学品的生产与生长耦合，从而细胞能够生长的唯一方式是将供给的碳源代谢为期望的化学品(例如见Jantama等008a；Jantama等2008b；(Zhu，Tan等2014)；美国专利第8,691,539号；美国专利第8,871,489号；WO专利申请WO2011063055A2)。在构建了这样的菌株之后，可使其经受如下所述的称为“代谢进化”的过程。对于代谢进化的方法，使菌株生长在适当的条件下，比如在上述涉及琥珀酸的生产的示例中，在伴随pH控制的微需氧条件下，在最小的葡萄糖培养基中生长许多代，通过允许从小接种体(例如，以约0.01至0.5的低的起始OD600)生长足够的时间，以便发生实质的生长(例如，达到约1至30的OD600)，然后再次以约0.01至0.5的低的OD600将该培养物接种至新鲜的培养基中，然后重复整个过程多次，直到培养物中进化出更快生长的菌株。在以上示例中，再接种的每个步骤也称为“转移”。每次转移时的发酵可为分批的或补料的。作为可选方案，不是重复地转移到新鲜的培养基中，而是可在连续的培养物(也称为“恒化器”、“auxostat”或“pHstat”)中实现代谢进化，其中将新鲜的培养基以可控的方式泵入或虹吸到充分混合的发酵罐中，并且以相似的速率去除发酵液，使得培养物的工作体积保持恒定，并且细胞生长的速率能够通过进入的新鲜培养基跟上稀释的速率。在恒化器中，调节进料速率以维持特定的细胞密度。在auxostat中，通过测量营养物或产物的浓度来确定进料速率，目的是维持所述营养物或产物的一定浓度。在pHstat中，调节进料速率以维持特定的期望的pH。随着生长速率因进化而增加，进料速率也增加，以允许连续的选择更快生长的变体。在任一类型的代谢进化(即转移或连续培养)期间，在个体细胞中出现自发突变。如果偶然的情况下，自发突变赋予了生长优势，那么突变细胞的后代将缓慢地或快速地(取决于生长优势的大小)超越其他细胞生长并占领种群。在代谢进化过程期间的任何时候，都可以通过在含有等价培养基加上2％琼脂的陪替氏平皿上划线来从液体培养物中分离出个体细胞，并且与起始菌株和中间分离物相比，可以挑选和测试个体菌落。用于代谢进化的优选起始菌株是已通过完全缺失相关基因而消除了不希望的竞争途径的菌株，从而任何不希望的途径都不太可能通过回复或抑制而重新出现。在任何给定步骤中，可以将培养物暴露于诱变剂，例如亚硝基胍(NTG)、甲烷磺酸乙酯(EMS)、过氧化氢或紫外线辐射，以便增加突变的频率。在已通过代谢进化获得了经济上有吸引力的菌株后，可以通过本领域公知的任何方法对其基因组进行测序，例如鸟枪克隆和测序、Illumina平台和PacBio平台。然后可将所得的DNA序列与起始菌株或祖先菌株的DNA序列比较，从而可以鉴定在代谢进化期间发生的每个突变。可选地，可以通过下述而以单独的或组合的方式研究每个突变：将野生型等位基因(多个野生型等位基因)重新安装到进化的菌株中以研究哪些突变有助于观察到的产物形成的改善，或者“逆向工程”，其中将来自基因组序列的个体突变或起组合引入天然或野生型菌株。已经对被工程改造以产生琥珀酸、乙醇和D-乳酸以及其他产物的大肠埃希杆菌(大肠埃希杆菌)菌株进行了上述过程(例如，WO专利申请WO2011063055A2)。通常，设计用于处理原始基因组序列数据并将原始数据组装成完整的基因组序列的各种软件包，例如LasergeneGenomicSuite，产生当与参考(亲本)菌株比较时进化的菌株中发现的突变表。然而，这样的计算机生成的表可能是不完整的或难以精确地说明，尤其是对于重复的DNA序列。例如，大肠埃希杆菌菌株通常含有各种插入(IS)元件的多个拷贝。例如，大肠埃希杆菌Crooks(ATCC8739)，Genbank登录号NC_010468，含有许多IS4的拷贝。由于IS4为约1400个碱基对，而Illumina平台序列读数的长度仅为50-250个碱基，而双端读数通常来自长度约为500个碱基对的片段，因此测序软件无法准确地放置不同的IS4的变体，因为来自IS4拷贝的中间的序列读数将不与周围的DNA重叠。此外，即使使用PacBio平台可能具有更长的读数，在含有许多基因的大型重复中间的多样化的等位基因(比如本文公开的复制的类型)也将不易处理。众所周知，一个或多个基因的复制在菌株开发期间发生(Elliott，Cuff等2013)。例如，在产生青霉素的菌株的开发中，这主要通过诱变和筛选完成(与基因工程和代谢进化相对)，青霉素生物合成基因簇显示出自发扩增直至5或6个串联拷贝(Fierro，Barredo等1995)。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中基因盒的有意扩增是公知的方法，其中进入的盒含有抗生素抗性基因，例如四环素抗性基因，其提供有限的抗性，然后通过使菌株在增加抗生素的浓度时生长而使得到的转化体进化以获得更高的抗性(EP1214420)。然后确认所得菌株在串联重复中具有约2至7个盒的拷贝。然而，如果菌株在没有抗生素的情况下生长，则这样的串联重复可通过同源重组塌缩成单个拷贝。另一方面，在高浓度的抗生素的存在下生长是不切实际和不期望的。在大肠埃希杆菌中使用相似的方法扩增整合盒的拷贝数(Tyo，Ajikumar等2009)。然而，再一次使用抗生素抗性基因以实现扩增，并且缺失了recA基因以保留扩增的拷贝数。众所周知，recA细胞的群体含有高百分比的死细胞，因此这种方案并不理想。在动物细胞中也已实现了基因拷贝数的扩增，但是当去除特定的选择压力时，拷贝数不稳定(Tyo，Ajikumar等2009)。还已知在酵母菌属(Saccharomyces)酵母中的以串联阵列的基因盒的扩增(US7,527,927，(Lopes，deWijs等1996))。待扩增的盒可以含有与重复的核糖体DNA基因同源的序列和可选择的标记，比如抗生素G4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有稳定的功能DNA序列的拷贝数的非天然存在的微生物，所述非天然存在的微生物包括功能DNA序列的n个拷贝和在所述功能DNA序列的所述n个拷贝的至少一个相邻的对之间的至少一个可选择的标记，其中所述非天然存在的微生物是祖先微生物的后代，其中所述祖先微生物包括不多于所述功能DNA序列的n-1个拷贝，并且其中n为至少2。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 US 62/527,442;20171110 US 62/584,2701.一种具有稳定的功能DNA序列的拷贝数的非天然存在的微生物，所述非天然存在的微生物包括功能DNA序列的n个拷贝和在所述功能DNA序列的所述n个拷贝的至少一个相邻的对之间的至少一个可选择的标记，其中所述非天然存在的微生物是祖先微生物的后代，其中所述祖先微生物包括不多于所述功能DNA序列的n-1个拷贝，并且其中n为至少2。


2.如权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物是细菌、酵母、丝状真菌或古细菌。


3.如权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物选自由下述组成的组中：埃希杆菌属、克雷伯杆菌属、酵母菌属、青霉属、芽孢杆菌属、伊萨酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、棒状杆菌属、链霉菌属、放线菌属、梭菌属、曲霉属、木霉属、根霉菌属、毛霉菌属、乳酸杆菌属、连接酵母属和克鲁维酵母菌属。


4.如权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中所述微生物是大肠埃希杆菌或马克斯克鲁维酵母菌。


5.如权利要求4所述的非天然存在的微生物，其中所述功能DNA序列是在B重复中重复的序列，PDR12基因或PDR12基因的同源物。


6.如权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中所述可选择的标记是编码磷酸丙糖异构酶的基因或用于代谢蔗糖的盒。


7.如权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中在相似的培养条件下，所述微生物产生的期望的发酵产物的滴度比所述祖先微生物产生的所述期望的发酵产物的所述滴度大至少10％。


8.一种用于创建具有稳定的功能DNA序列的拷贝数的非天然存在的微生物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供包括功能DNA序列的n个拷贝的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是祖先微生物的后代，其中所述祖先微生物包括不多于所述功能DNA序列的n-1个拷贝，其中n为至少2；和
(b)在所述功能DNA序列的所述n个拷贝中的至少一个相邻的对之间，将至少一个可选择的标记插入到所述非天然存在的微生物中，以使所述功能DNA序列的所述拷贝数稳定化。


9.如权利要求8所述的方法，其中所述微生物是细菌、酵母、丝状真菌或古细菌。


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【专利技术属性】
技术研发人员：罗杰·R·约卡姆，T·格拉巴，泰龙·赫尔曼，克里斯托弗·约瑟夫·马丁，莱恩·西勒斯，余晓辉，周小美，
申请(专利权)人：PTT全球化学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：泰国;TH