具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母制造技术

基于产量和滴度，具有增加的琥珀酸产生的改进的酵母细胞。磷酸戊糖途径中涉及的一种或多种酶的增加的活性、通过磷酸葡萄糖异构酶减少通量、增加至细胞质乙酰辅酶A的通量、苹果酸酶的设置和/或甲酸脱氢酶的设置导致增加的琥珀酸的产生。

Genetically modified yeast with increased succinic acid production

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母相关申请的交叉引用本申请要求于2017年6月30日提交的美国临时专利申请第62/527,351号的优先权。关于联邦资助的研究或开发的声明不适用联合研究协议不适用
技术介绍
本专利技术涉及基于生物的化学品产生。更具体地，本专利技术涉及使用基因修饰的酵母由可再生碳源产生琥珀酸。琥珀酸是三羧酸(TCA)循环中的中间产物，并且已知许多细菌都具有产生作为主发酵产物的琥珀酸的自然能力。对于琥珀酸或琥珀酸的盐(二者也被称为“琥珀酸盐”)的商业需求扩大。2004年美国能源部的一份名为“生物质带来的最高附加值化学品(TopValueAddedChemicalsfromBiomass)”报告确认了琥珀酸作为可由可再生原材料产生的十二种构成要素化学品之一。琥珀酸在多种特殊化学品(例如1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯和N-甲基吡咯烷酮)的制造中作为起始材料使用。琥珀酸作为大宗化学品具有用于制造各种产品的潜力，包括动物饲料、增塑剂、冷却剂、聚合物、纤维和塑料，尤其是聚琥珀酸丁二酯(也被称为“聚琥珀酸丁二醇酯”或“PBS”)。许多由琥珀酸盐制成的聚合物以比来源于石油的其他聚合物(例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET))以更快的速率生物降解。因而，由琥珀酸盐制成的塑料非常符合需要，因为其在填埋场或其他堆肥环境中会更快地腐烂。(Kunioka，Ninomiya，&Funabashi，2009)。在单体亚单元是生物来源的化合物或其化学等效物，而不是通常在生物体中不多见的石油化学来源的化合物时，这种性质也可推及许多其他聚合物和塑料。例如，在堆肥环境中，衍生自富马酸(富马酸盐)、苹果酸(苹果酸盐)、己二酸(己二酸盐)、L-乳酸(L-乳酸盐)、D-乳酸(D-乳酸盐)和/或其他自然存在的有机酸的聚合物都比许多石油化学来源的聚合物更容易降解。因而，为了人类的利益，用由生物化学品制成的聚合物和塑料来代替目前的由石油化学品制成的聚合物和塑料是合乎需要的。许多生物化学品，例如琥珀酸盐、富马酸盐和己二酸盐，都可由石油制造，并且目前使用的许多产生PBS和尼龙的工艺都使用石油来源的单体。然而，由于世界的石油供应是有限的，因此也需要开发通过可再生碳源，例如糖类、糖聚合物、甘油、脂肪酸、二氧化碳、木质素或任何其他形式的生物质或来源于生物质的废料发酵来生产生物化学品单体的原料和方法。因此，开发由可生物再生的资源制造可生物降解的塑料的方法是合乎需要的。产生许多上述的生物化学品的生物方法使用不能在低pH条件下生长的生物体。因此，当产生有机酸时，必须通过添加碱，通常是钠、钾、铵、镁或钙的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或它们的混合物来使培养基的pH保持在约5至约7.5。因此，有机酸在培养液中作为盐存在，并且大多数有机酸分子是带电的。带电状态有优点也有缺点。优点是，带电的盐不容易穿过细胞膜扩散进入细胞内。缺点是，使用有机酸的聚合化学物质或其他化学品通常要求有机酸的质子化形式(也被称为“游离酸”)，从而通过发酵产生的盐需要可能非常昂贵的下游处理来提供游离酸形式。因而，在低pH条件下(pH接近，或更优选地，低于有机酸的最低pKa)产生有机酸，从而使大部分分子为游离酸状态是有利的。此外其他的考虑是，低pH发酵液应该更为低廉以处理提供游离酸的纯制剂，因为在发酵期间必须提供并且然后在发酵后分离少得多的反离子(例如钠、钾、铵、镁、钙)以提供质子化的琥珀酸。现有一些使用各种酵母作为产生宿主在低pH条件下产生有机酸的方法。WO2012/103261公开了已被工程化为产生琥珀酸盐或苹果酸盐的东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)菌株。这些菌株来源于从一组许多不同的酵母种中选出的作为在低pH条件下对高浓度琥珀酸盐耐受力最强的野生型亲代。尤其，当与马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)相比时，所选择的东方伊萨酵母(I.orientalis)菌株对琥珀酸盐的耐受力更强。然而，如之前公开的(WO2014/043591)，已经分离了马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)的新的野生型菌株，在丰富培养基中生长时，其在低pH条件下比东方伊萨酵母(I.orientalis)菌株对于琥珀酸盐具有更好的耐受力。因此，在一个物种内不同的菌株之间在低pH条件下对有机酸的耐受力方面显然存在一些差异，并且筛选进行的精确条件可能会影响这些筛选的结果。另外，已经针对琥珀酸盐产生开发了酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株，但是再一次，公开(WO2014/043591)的马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)菌株在低pH条件下对琥珀酸盐的耐受性更强。而且，马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)可自然地发酵木糖，因此其作为产生琥珀酸盐的宿主酵母，相比于酿酒酵母(S.cerevisiae)具有第二个优点。尽管由于在酵母中以膜结合的细胞器的形式进行亚细胞区室化而在以酵母发酵的低pH条件中具有产生二元羧酸(例如，琥珀酸)的理论优势，但在酵母中产生工程化的琥珀酸盐几乎不像在大肠杆菌(E.coli)或其他细菌中那样直接。首先，在酵母属(Saccharomyces)中，并且如果不是全部的话，可能在大多数其他酵母中，在好氧条件下，TCA循环在线粒体或前线粒体内部运行(WO2008/128522，WO2010/043197)。在缺少特异性琥珀酸盐转运体的情况下，线粒体内膜对于琥珀酸盐而言是不可渗透的(Lee等人，2011)，但蛋白质转运体以交换富马酸盐或磷酸盐的方式将琥珀酸盐输入到线粒体中是已知的(Palmieri等人，2000)。然而，不存在从线粒体向细胞质分泌琥珀酸盐的已知机制，从而从TCA循环，甚至支路模式中产生的琥珀酸盐不容易被运输至线粒体外并由此到达细胞外。因而，在现有技术中认识到，通过在到苹果酸盐和琥珀酸盐的还原性途径中布置在线粒体外的细胞质中存在且活性足够高的关键酶(例如丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶)，从而在细胞质中工程化生物合成二元羧酸(例如苹果酸盐和琥珀酸盐)是合乎需要的(US2008/0090273、US2012/0040422、WO2010/003728、WO2011/023700、WO2009/101180和WO2012/038390、WO2008/128522、WO2010/043197)。然而，现有技术并未充分认识到或解决如何从线粒体输出琥珀酸盐或如何在厌氧或微好氧条件下达到氧化还原平衡，并同时从酵母中的葡萄糖或其他碳源最大化地产生琥珀酸盐的问题。而且，线粒体内和线粒体外的所有相关酶的产生和活性的规则极其复杂，并且如何达到工程化产生适当的水平也不明确。最后，线粒体膜对于NAD和NADH是不可渗透的，并且在厌氧或微好氧条件下如何在线粒体基质和细胞质之间达到有效的氧化还原平衡也不明确。本文公开的
技术实现思路
认识到了这些挑战并提供了解决这些问题的方案。
技术实现思路
本专利技术提供了具有改变的代谢途径可用于在细胞质中产生有机酸，比如苹果酸、富马酸和琥本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，包括通过磷酸戊糖途径增加通量的至少一种基因修饰和增加至少一种琥珀酸生物合成途径中的至少一种酶的活性的至少一种基因修饰。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 US 62/527,3511.一种具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，包括通过磷酸戊糖途径增加通量的至少一种基因修饰和增加至少一种琥珀酸生物合成途径中的至少一种酶的活性的至少一种基因修饰。


2.根据权利要求1所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述通过所述磷酸戊糖途径增加通量的至少一种基因修饰增加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF)的活性。


3.根据权利要求1所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述通过所述磷酸戊糖途径增加通量的至少一种基因修饰降低葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸葡萄糖异构酶(PGI)的活性。


4.根据权利要求1所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述通过所述磷酸戊糖途径增加通量的至少一种基因修饰降低磷酸葡萄糖异构酶(PGI)的活性，并且增加选自由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(GND)组成的组中的一种或多种酶的活性。


5.根据权利要求1所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述至少一种琥珀酸生物合成途径中的至少一种酶选自由苹果酸酶(MAE)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)、丙酮酸羧化酶(PYC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)、苹果酸脱氢酶(MDH)、延胡索酸酶(FUM)和延胡索酸还原酶(FRD)组成的组中。


6.根据权利要求1所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，进一步包括降低丙酮酸羧化酶的活性的至少一种基因修饰。


7.一种具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，包括增加苹果酸酶的活性的至少一种基因修饰和增加选自由NADH、NADPH和FADH组成的组中的至少一种还原辅因子可用性的至少一种基因修饰。


8.根据权利要求7所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述苹果酸酶是NADH依赖性苹果酸酶。


9.根据权利要求7所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细...

【专利技术属性】
技术研发人员：莱恩·西勒斯，
申请(专利权)人：PTT全球化学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：泰国;TH