一种用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的引物、探针及应用制造技术

本申请公开了一种检测多粘菌素耐药基因mcr‑5的引物及探针，并将其制备成试剂盒。涉及分子生物学技术领域，包括1对引物和1个探针，并提供了检测试剂盒和非诊断治疗的检测方法和引物组的应用。本发明专利技术仅需具备温控功能的荧光检测仪器，39℃条件下对mcr‑5进行快速、准确、便捷的检测，20min即可得检测结果，灵敏度可达1copies/μL。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的引物、探针及应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的引物、探针及应用。
技术介绍
多粘菌素是聚阳离子多肽类药物，对革兰氏阴性菌耐药菌引起的感染具有良好的疗效，尤其是在耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistantenterobacteriaceae，CRE)等超级耐药菌的治疗上，常作为最后一道防线类药物。多粘菌素耐药基因mcr由质粒介导，可在不同菌株间进行水平转移，通过介导磷酸乙醇胺转移作用的酶，来参与多粘菌素的耐药过程，此引起了全世界的广泛关注；多粘菌素在医学临床、畜牧业及农业上使用的逐年增加及不合理用药情况，给公共卫生安全和畜牧业发展构成了严重威胁。重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右；此方法与常规PCR、Sanger测序、荧光定量PCR和LAMP等方法相比，不需要复杂的仪器、耗时短、灵敏度高。mcr-5属于mcr基因家族，首先在嗜水气单胞菌中被发现，mcr-5与以往所报道的任何一类mcr亚型皆亲缘关系较远，但结构与功能分析显示mcr-5与mcr家族的其他成员一样，具有一系列保守的功能残基，包括5个锌离子结合位点与7个PE底物接纳的氨基酸，同时亦发现mcr-5的表达可缓解细菌体内ROS的产生，并引起了代谢适应性损伤，虽然mcr-5具有不同的进化起源，但其依旧保留了相同的生化机制，具有介导多粘菌素耐药的能力。目前，国内外应用该技术建立了一些致病微生物的新型检测方法，还没有针对mcr-5的RPA检测方法。因此，如何提供一种针对mcr-5的RPA检测方法是本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术公开了一种用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的引物、探针及应用，在体温条件下，即可对mcr-5进行快速、实时、灵敏、准确、便捷的检测。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种检测多粘菌素耐药基因mcr-5的引物及探针，引物及探针序列如下：mcr-5-F3：5’-GTCCGTGCTGCACGTTTTAAACCGTAGTGACGTC-3’，SEQ.ID.NO.1；mcr-5-R1：5’-AGGCAGCGCTCGCCATGGCACAGTGTGGGATG-3’，SEQ.ID.NO.2；mcr-5-probe：5’-GCGATAACCAGTCGGGCTGTAAAGGCGTCGTGATGGACTGCCCTT-3’，SEQ.ID.NO.3；探针距离5’端第28位T为FAM荧光基团标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，第29位和第30位之间插入四氢呋喃分子，第31位T为荧光淬灭基团BHQ标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。一种用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的试剂盒，试剂包括：mcr-5-F3、mcr-5-R1、mcr-5-probe、冻干酶粉、聚乙二醇、醋酸镁溶液和去离子水；各引物浓度为10μmol/L；探针浓度为10μmol/L；醋酸镁溶液为280mmol/L；所述冻干酶粉由以下成分：220ng/μL重组酶RecA11μg、200ng/μL单链DNA结合蛋白gp3210μg、100ng/μLDNA聚合酶IKlenow5μg、70ng/μL辅助蛋白uvsY3.5μg、80ng/μL核酸外切酶exoIII4μg、3％聚乙二醇1mg、30mMTris0.12mg、120mM乙酸钾0.49mg、3mMATP0.05mg、50mM磷酸肌酸二钠盐0.51mg、275μMdNTP250μM、6％蔗糖2.5mg和30％甘油1mg，冷冻干燥制得；冻干条件为-80℃条件下预冻3～4h，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，先于-20～-45℃干燥2～10h，最后10～18℃干燥1～2h；优选的，反应体系为50μL，包括：所述冻干酶粉、去离子水28.4μL、聚乙二醇12.5μL、10μmol/L的引物各2μL、探针0.6μL、DNA模板2μL，醋酸镁溶液2.5μL；一种用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：向含有冻干酶粉的反应管中依次加入去离子水28.4μL、聚乙二醇12.5μL、引物各2μL、探针0.6μL、DNA模板2μL，醋酸镁溶液2.5μL，充分混匀后将反应试管置于39℃恒温反应20min；对于低拷贝数的模板DNA，39℃恒温反应4min后拿出反应管再次混匀，离心3～5s。重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列，一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增，被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换；在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件，整个过程进行得非常快，一般可在10-15min之内获得可检出水平的扩增产物。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，RPA引物的长度一般为30至35个碱基，引物过短会严重影响重组酶的活性；长引物实际上也是可以使用的，如45个碱基的引物就曾成功用于RPA扩增；不过，长引物并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性，增大来自引物的噪音。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。就因如此，引物的的高级结构作用显得更为明显，高级结构虽然可以被预测，但在实际反应体系中，高级结构互作过程以及具体参数还不明确；但总体来说，RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，用户需要自己摸条件进行优化。综上所述，本专利技术方法是通过参考GenBank中粘菌素耐药基因mcr-5序列，选择特异性保守区域，设计大量RPA引物及探针，从中筛选出一套可快速有效检测出粘菌素耐药基因mcr-5基因成分的引物及探针组合。利用该引物和探针进行快速扩增及实时荧光检测，可在pUC-mcr-1、pUC-mcr-2、pUC-mcr-3以及pUC-mcr-5中特异性检测出pUC-mcr-5，说明该方法具有良好的特异性，检测限值可达1拷贝/μL，其检测时间为LAMP检测方法的一半，是荧光PCR方法的三分之一。附图说明图1为引物筛选示意图，其中a：F3、R1引物对扩增曲线；b：F1、R2引物对扩增曲线；c：F2、R2引物对扩增曲线；d：F2、R3引物对扩增曲线；e：F1、R3引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测多粘菌素耐药基因mcr-5的引物及探针，其特征在于，引物及探针序列如下：/nmcr-5-F3：5’-GTCCGTGCTGCACGTTTTAAACCGTAGTGACGTC-3’，SEQ.ID.NO.1；/nmcr-5-R1：5’-AGGCAGCGCTCGCCATGGCACAGTGTGGGATG-3’，SEQ.ID.NO.2；/nmcr-5-probe：5’-GCGATAACCAGTCGGGCTGTAAAGGCGTCGTGATGGACTGCCCTT-3’，SEQ.ID.NO.3；/nmcr-5-probe距离5’端第28位T为FAM荧光基团标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，第29位和第30位之间插入四氢呋喃分子，第31位T为荧光淬灭基团BHQ标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测多粘菌素耐药基因mcr-5的引物及探针，其特征在于，引物及探针序列如下：
mcr-5-F3：5’-GTCCGTGCTGCACGTTTTAAACCGTAGTGACGTC-3’，SEQ.ID.NO.1；
mcr-5-R1：5’-AGGCAGCGCTCGCCATGGCACAGTGTGGGATG-3’，SEQ.ID.NO.2；
mcr-5-probe：5’-GCGATAACCAGTCGGGCTGTAAAGGCGTCGTGATGGACTGCCCTT-3’，SEQ.ID.NO.3；
mcr-5-probe距离5’端第28位T为FAM荧光基团标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，第29位和第30位之间插入四氢呋喃分子，第31位T为荧光淬灭基团BHQ标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。


2.一种用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的试剂盒，其特征在于，试剂包括：mcr-5-F3、mcr-5-R1、mcr-5-probe、冻干酶粉、聚乙二醇、醋酸镁溶液和去离子水。


3.一种如权利要求2所述用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的试剂盒，其特征在于，各引物浓度为10μmol/L。


4.一种如权利要求2所述用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的试剂盒，其特征在于，探针浓度为10μmol/L。


5.一种如权利要求2所述用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的试剂盒，其特征在于，醋酸镁溶液为280mmol/L。

<...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘少宁，李有志，陈智，杨瑞，牛华星，张呈军，
申请(专利权)人：山东省兽药质量检验所山东省畜产品质量检测中心，
类型：发明
国别省市：山东;37