用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒、反应体系和方法技术

本发明专利技术公开用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒、反应体系和方法。本发明专利技术的试剂盒包含能够以混合物形式存在的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针，其中，第一引物和第一探针用于在实时荧光PCR第一通道中检测以多拷贝存在的第一靶基因，第二引物和第二探针用于在实时荧光PCR第二通道中检测以单拷贝存在的第二靶基因是否存在耐药相关突变，第二引物中的正向引物和反向引物的摩尔比为1:15‑25，且第二探针的Tm值为73‑76℃。第三引物和第三探针用于在实时荧光PCR第三通道中检测内部质控。本发明专利技术不仅可以检测样品是否存在肺孢子菌，并且还可通过熔解曲线分析检测真菌样本对例如磺胺类药物的耐药性。

【技术实现步骤摘要】
用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒、反应体系和方法
本专利技术涉及肺孢子菌检测领域，具体地涉及用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒、反应体系和方法。
技术介绍
肺孢子菌病(Pneumocystispneumonia)是由肺孢子菌(P.jirovecii)引起的原虫病，多见于免疫功能低下或缺陷者。目前，广泛的磺胺药物预防法和高效抗逆转录病毒疗法(HAART)减少了肺孢子菌病的发病率，但其仍然成为HIV/AIDS患者以及非HIV免疫功能低下患者发病和死亡的重要原因。临床上肺孢子菌的诊断方法是支气管肺泡灌洗液(BAL)样本的直接镜检，通过标准染色技术和免疫荧光法显色。当样本中真菌载量低时，该方法诊断困难并且需要较高的技术水平。目前，实时PCR法开始被用于肺孢子菌病的检测，其灵敏度高于直接镜检。例如，在《中国病原生物学杂志》第12卷第10期公开了多重定量PCR在肺孢子菌肺炎诊断中的应用，具体公开了提取PCP患者呼吸道标本DNA，分别以Pj线粒体大亚基rRNA(mtLSUrRNA)、主要表面糖蛋白(Msg)、二氢叶酸合成酶为靶基因进行定量PCR检测，以临床诊断为金标准评价Mt-qPCR、Msg-qPCR和DHPS-qPCR3种方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。由此证明以临床诊断为金标准，Mt-qPCR方法优于Msg-qPCR和DHPS-qPCR，联合使用含有Mt-qPCR在内的2种以上qPCR方法能提高PCP诊断的符合率。综上所述，目前可以基于实时PCR法，通过检测例如多拷贝mtLSU，从而确定肺孢子菌的感染，通过LSU标准曲线定量检测样本中肺孢子菌浓度。并且目前临床上对肺孢子菌耐药株的重视程度较低，仍没有建立同时标准化且有效的耐药检测方法。
技术实现思路
针对现有技术中的至少部分技术问题，本专利技术提供能够同时检测肺孢子菌及其耐药性的方案。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的第一方面，提供一种用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其包含能够以混合物形式存在的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针，其中，第一引物和第一探针用于在实时荧光PCR第一通道中检测以多拷贝存在的第一靶基因，第二引物和第二探针用于在实时荧光PCR第二通道中检测以单拷贝存在的第二靶基因是否存在耐药性相关突变，第二引物中的正向引物和反向引物的摩尔比为1:15-25，且第二探针的Tm值为73-76℃。第三引物和第三探针用于在实时荧光PCR第三通道中检测内部质控。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒中，所述混合物溶解于缓冲液中，且所述缓冲液包含190-210mMTris-HCl、190-210mMKCl、90-110mM(NH4)2SO4、15-25mMMgSO4，且pH值为8.0-8.5。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒进一步包含LSU标准样品和对照样品。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒中，所述第一靶基因为mtLSU，所述第二靶基因为DHPS。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒中，所述第一引物的序列如SEQIDNO:1和2所示，所述第二引物的序列如SEQIDNO:3和4所示，所述第三引物的序列如SEQIDNO:7和8所示。所述第一探针的序列如SEQIDNO:5所示，所述第二探针的序列如SEQIDNO:6所示，所述第三探针的序列如SEQIDNO:9所示。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒进一步包含内部质控样品，且所述用于第一靶基因检测的染料为ATTORho101，用于第二靶基因检测的染料为MAX，和用于内部质控检测的染料为ATTO647N。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒中，控制所述内部质控样品的Ct值在28.0-35.0范围内。本专利技术的第二方面，提供一种用于检测肺孢子菌及其耐药性的反应体系，其包含溶解于缓冲液的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针，其中，第一引物和第一探针用于在实时荧光PCR第一通道中检测以多拷贝存在的第一靶基因，第二引物和第二探针用于在实时荧光PCR第二通道中检测以单拷贝存在的第二靶基因是否存在耐药相关突变，第二引物中的正向引物和反向引物的摩尔比为1:15-25，且第二探针的Tm值为73-76℃。第三引物和第三探针用于在实时荧光PCR第三通道中检测内部质控。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的反应体系，其中，所述第一引物与第二引物的摩尔比2-3.5:1。本专利技术的第三方面，提供一种用于检测肺孢子菌及其耐药性的方法，其包括使用第一方面所述的试剂盒的步骤。本专利技术不仅可以检测样品是否存在肺孢子菌，并且还可通过熔解曲线分析检测例如DHPS基因中可引起氨基酸改变的55和57位点的突变，从而检测真菌样本对例如磺胺类药物的耐药性。附图说明图1用于染料筛选的mtLSU的扩增曲线。其中，1、2、3为AttoRho101染料，4、5、6为ROX染料。图2用于染料筛选的内部质控的扩增曲线。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。本专利技术的试剂盒用于同时检测肺孢子菌及其耐药性，而无需分别单独进行检测。同时检测是指在能够在同一反应体系中一次性检测出样品中是否含有肺孢子菌以及该菌是否包含耐药性突变。本专利技术的试剂盒能够构建用于多重实时荧光PCR反应的反应体系。试剂盒包含能够以混合物形式存在的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针。在一种示例性实施方式中，所有引物和探针以干燥粉末混合物的形式存在于容器，如小瓶。在另一示例性实施方案中，所有引物和探针溶解于缓冲液以形成混合物的形式存在于容器，如小瓶。本专利技术中，为了能够实现同时检测的目的，本专利技术的缓冲液可包含Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4和M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，包含能够以混合物形式存在的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针，其中，第一引物和第一探针用于在实时荧光PCR第一通道中检测以多拷贝存在的第一靶基因，第二引物和第二探针用于在实时荧光PCR第二通道中检测以单拷贝存在的第二靶基因是否存在耐药相关突变，第二引物中的正向引物和反向引物的摩尔比为1:15-25，且第二探针的Tm值为73-76℃。第三引物和第三探针用于在实时荧光PCR第三通道中检测内部质控。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，包含能够以混合物形式存在的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针，其中，第一引物和第一探针用于在实时荧光PCR第一通道中检测以多拷贝存在的第一靶基因，第二引物和第二探针用于在实时荧光PCR第二通道中检测以单拷贝存在的第二靶基因是否存在耐药相关突变，第二引物中的正向引物和反向引物的摩尔比为1:15-25，且第二探针的Tm值为73-76℃。第三引物和第三探针用于在实时荧光PCR第三通道中检测内部质控。


2.根据权利要求1所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，所述混合物溶解于缓冲液中，且所述缓冲液包含190-210mMTris-HCl、190-210mMKCl、90-110mM(NH4)2SO4、15-25mMMgSO4，且pH值为8.0-8.5。


3.根据权利要求1所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，进一步包含LSU标准样品和对照样品。


4.根据权利要求1所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，所述第一靶基因为肺孢子菌线粒体核糖体大亚基rRNA基因mtLSU，所述第二靶基因为二氢叶酸合成酶基因DHPS。


5.根据权利要求1所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，所述第一引物的序列如SEQIDNO:1和2所示，所述第二引物的序列如SEQIDNO:3和4所示，所述第三引物的序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏小凯，程天龄，朱丽媛，吉斯·丁格曼斯，
申请(专利权)人：上海捷诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31