一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物技术

本发明专利技术公开了一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物，所述检测方法，包括如下步骤：1)制备含有阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液；2)将步骤1)中制备的裂解培养液分别与标准菌株梯度悬液及样品稀释液共培养；3)通过qPCR测定步骤2)中共培养物Ct值变化量；4)根据步骤3)中△Ct值与标准菌株梯度悬液活菌数的线性关系计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞数，实现样品中阪崎肠杆菌存活细胞数快速定量测定。本发明专利技术中的检测方法对死亡细胞和其他菌株无交叉反应，检测周期为5.5h，检测通量高，适合于食品或环境样本中阪崎肠杆菌存活细胞的定量检测，以及快速评价消毒杀菌条件对阪崎肠杆菌的有效性。

【技术实现步骤摘要】
一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法及其引物。
技术介绍
阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii，Es)为革兰氏阴性短杆菌，是一种重要的食源性致病菌，能引起新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎，死亡率达40％-80％。国际食品微生物标准委员会(ICMSF)将Es定义为“对特定人群可产生严重的生命危害及产生慢性实质性或长期影响的后遗症”的致病菌。研究显示Es广泛分布于环境中，其生长速度快，具有耐高参透压，抗干燥特性，在水分活度(Aw)0.3-0.69条件下可存活，低温条件下抗干燥能力增强，极易污染婴幼儿奶粉、乳制品、肉制品等食品，引发食源性疾病爆发。由于Es致病性高和传播性强，是食品中必检的微生物指标之一，建立精确的Es快速检测技术对控制该菌引起的疾病具有重要意义。目前Es检测方法主要有传统微生物培养法、分子生物学检测法和免疫学检测法等。其中，传统微生物培养法是通过分离、纯化培养、生化鉴定等检测手段，该方法技术成熟，但操作繁琐、检测周期长，不利于突发事件中对阪崎肠杆菌的快速检测。分子生物学检测法主要以Es特异性基因序列设计相应的特异性引物，建立基于聚合酶链式反应(PCR)的快速检测方法，这些方法具有特异性好、快速灵敏度等优势，但是只能检测Es的总细胞数，无法辨别样品中Es细胞死亡/存活状态。此外，在食品加工中，往往需要快速筛查食品以及环境样本Es存活细胞的数量，判断加工手段对Es灭活的有效性和可靠性，现有的基于PCR快速检测无法提供有效结果。因此建立PCR联合其他特异性识别Es存活细胞的快速检测技术具有广阔的应用前景。噬菌体具有严格的宿主特异性，能识别一定范围的宿主菌。噬菌体随着宿主生长而复制，具有区分宿主菌细胞死活的能力，目前尚无利用噬菌体联合qPCR进行Es存活细胞的快速检测的报道。
技术实现思路
专利技术目的：针对上述技术问题，本专利技术提供了一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，有效实现了阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测。本专利技术还提供了一种用于阪崎肠杆菌存活细胞特异性快速定量检测的引物。技术方案：为了达到上述专利技术目的，本专利技术所述一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，包括如下步骤：1)制备含有阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液；2)将步骤1)中制备的裂解培养液分别与标准菌株梯度悬液及样品梯度悬液共培养；3)通过qPCR测定步骤2)中共培养物Ct值变化量(△Ct)。4)根据步骤3)中△Ct值与标准菌株梯度悬液的活菌数的线性关系计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞数。其中，步骤1)中制备的培养液灭菌冷却后加入过滤除菌处理的噬菌体悬液，制成含有102-106PFU/mL阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液；作为优选，制成含有103PFU/mL阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液。作为优选，通过常规方法称取1g蛋白胨，0.3g牛肉膏，0.5gNaCl，0.5gCaCl2，0.5gCaCl2，蒸馏水定容至100mL，调节pH为7.5，121℃灭菌15min制备培养液。作为优选，步骤1)中所述噬菌体阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05，保藏编号CCTCCNO：M2016716(CN107828743A)。其中，步骤2)中将样品进行匀浆、稀释处理，制备样品梯度悬液；制备标准菌株梯度悬液；将样品稀释液和标准菌株梯度悬液分别步骤1)制备的裂解培养液混合，混匀共培养。作为优选，所述通过常规方法将样品进行匀浆、稀释处理，制备样品梯度悬液或者稀释液；按常规方法制备标准菌株10倍梯度悬液；将样品稀释液和标准菌株10倍梯度悬液分别步骤1)制备的裂解培养液混合，200rmp涡旋混匀，37℃下共培养时间为4h，每隔30min取出200rmp涡旋混匀1min。其中，步骤3)中取步骤2)获得共培养物，离心上清液沸水浴后作为DNA模板建立qPCR反应体系，测定Ct值。作为优选，步骤3)中使用特异性的qPCR引物为：EspYZU05-ORF18-F1：5'-GGATATGAAGAATATCGTGGC-3'和EspYZU05-ORF18-R1：5'-GGATTGCATAACAACGACCG-3'；Ct值变化量(△Ct)为裂解培养液与标准菌株梯度悬液及样品梯度悬液共培养物Ct值，分别与裂解培养液和不含菌株的对照共培养物Ct值(Ct0)的差值。其中，步骤4)中将步骤3)中测定的Ct值变化量(△Ct值)和标准菌株梯度悬液的活菌数进行相关性分析，根据获得的线性方程，计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞含量。本专利技术所述用于特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测的引物，所述引物为：EspYZU05-ORF18-F1：5'-GGATATGAAGAATATCGTGGC-3'和EspYZU05-ORF18-R1：5'-GGATTGCATAACAACGACCG-3'。作为优选，本专利技术的具体检测过程包括如下步骤：(1)制备含有阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液。将噬菌体EspYZU05(CCTCCNO：M2016716)与宿主菌按照感染复数MOI＝1比例混合，静置10min后加入10mL液体培养基中，37℃、150r/min培养8h。培养液经6000r/min离心10min取上清，通过0.45μm孔径滤膜，滤过液4℃保存。应用常规双层平板法测定滤过液中噬菌体滴度，并用无菌SM缓冲液(SM缓冲液(5.80gNaCl，2gMgSO4·7H2O，0.10g明胶，50mL1MpH7.50Tris-HCl)将噬菌体悬液的滴度调节至107PFU/mL，备用。按常规方法称取1g蛋白胨，0.3g牛肉膏，0.5gNaCl，0.5gCaCl2，蒸馏水定容至100mL，调节pH为7.5，121℃灭菌15min；冷却后加入过滤除菌处理的噬菌体EspYZU05悬液至终浓度102、103、104、105、106PFU/mL，根据步骤(4)中△Ct变化范围，筛选△Ct变化最大的浓度作为特异性裂解培养液中的最佳噬菌体浓度，最优浓度是103PFU/mL。(2)噬菌体EspYZU05特异性核酸标志物筛选及引物设计与特异性验证。按常规方法提取噬菌体EspYZU05基因组DNA，通过IlluminaHiseq测序平台获得全基因组序列，通过比对筛选特异性核酸序列。依据EspYZU05基因组中特异性核酸序列ORF18基因，利用BLAST工具盒BioEdit软件线上分析设计引物的特异性，并委托商业化生物工程有限公司合成引物。获得的引物序列为：EspYZU05-ORF18-F1：5'-GGATATGAAGAATATCGTGGC-3'和EspYZU05-ORF18-R1：5'-GGATTGCATAACAACGACCG-3'。扩增产物大小为180bp。引物特异性验证具体为：选取EspYZU05基因组DNA以及其他基因组DNA作为模板，建立PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)制备含有阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液；/n2)将步骤1)中制备的裂解培养液分别与标准菌株梯度悬液及样品梯度悬液共培养；/n3)通过qPCR测定步骤2)中共培养物Ct值变化量(△Ct)；/n4)根据步骤3)中△Ct值与标准菌株梯度悬液的活菌数的线性关系计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞数。/n

【技术特征摘要】
1.一种能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备含有阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液；
2)将步骤1)中制备的裂解培养液分别与标准菌株梯度悬液及样品梯度悬液共培养；
3)通过qPCR测定步骤2)中共培养物Ct值变化量(△Ct)；
4)根据步骤3)中△Ct值与标准菌株梯度悬液的活菌数的线性关系计算样品中阪崎肠杆菌存活细胞数。


2.根据权利要求1所述的能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，步骤1)中将制备的培养液灭菌冷却后加入过滤除菌处理的噬菌体悬液，形成最终含有102-106PFU/mL阪崎肠杆菌噬菌体的特异性裂解培养液。


3.根据权利要求1所述的能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，步骤1)中所述的阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05，保藏编号CCTCCNO：M2016716。


4.根据权利要求1所述的能够特异性识别阪崎肠杆菌存活细胞的快速定量检测方法，其特征在于，步骤2)中优选将样品进行匀浆、稀释处理，制备样品梯度悬液；制备标准菌株梯度悬液；并将样品梯度悬液和标准菌株梯度悬液分别与步骤1)制备的裂解培养液混合，混匀，共培养。


5.根据权利要求1所述的能够特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨振泉，张元嵩，杨晓珺，周文渊，高璐，胡钦，郑香峰，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32