一种检测单增李斯特菌的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种检测单增李斯特菌的试剂盒和方法。本发明专利技术试剂盒包含MNPs修饰的捕获探针、生物素标记的信号探针、ALP‑SA、AAP、高锰酸钾等。本发明专利技术方法的原理为：单增李斯特菌基因组DNA与MNPs修饰的捕获探针、生物素标记的信号探针通过杂交形成双链夹心复合物，通过生物素‑亲和素系统将ALP‑SA连接到双链夹心复合物上，ALP能去除AAP中的磷酸基团将其转变为AA，AA会将MnO

【技术实现步骤摘要】
一种检测单增李斯特菌的试剂盒和方法
本专利技术涉及微生物的检测，具体涉及一种检测单增李斯特菌的试剂盒和方法。
技术介绍
近年来，随着人民生活水平的提高，食品安全日益受到关注，成为公共政策的重要议题。尤其是病原体引起的食源性疾病已严重威胁公共卫生安全和人类健康。单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)简称单增李斯特菌，是主要的食源性病原体之一，可对人类造成流感样疾病和严重并发症等症状，包括脑膜炎、败血症，甚至在脆弱人群中发生自然流产。因此，为保障公众食品安全，建立快速可靠的单增李斯特杆菌等食源性病原体检测方法是非常重要和必要的。各种分析方法已广泛应用于食源性病原体的检测，包括微生物培养、色谱-质谱、酶联免疫吸附试验(ELISA)和基于聚合酶链反应(PCR)的分析。尽管这些传统方法具有很高的敏感性和特异性，但仍然存在一些局限性。例如，细菌培养需要耗时和费力的程序和费力的任务；色谱-质谱需要昂贵的设备和复杂的预处理程序；PCR方法可能会遇到与样品基质相关的问题，因为样品基质可能包含生物样品中通常发现的PCR抑制剂。与上述方法相比，ELISA方法操作简单，适用于现场检测，但缺乏敏感性和抗干扰性能。因此，需要一种新的或改进的方法来实现对病原菌的快速、灵敏、准确的检测，并具有较高的抗变换性。为了开发检测技术以克服目前的限制，已经进行了多种研究，其中生物传感器已成为食品分析和生物检测中一种有前途的重要工具。相对于与电化学、电化学发光、比色和荧光相关的生物传感器，磁弛豫开关时间(MRS)生物传感器具有两个独特的优势，(1)信号标签易于分离或不需要分离步骤；(2)由于食品样品的磁信号背景较低，磁信号可以避免复杂样品基质对信号的干扰。其中，顺磁离子介导的MRS生物传感器具有更好的稳定性和更低的成本，因为顺磁离子如Fe3+/Fe2+、Cu2+/Cu+和Mn7+/Mn2+的价态变化导致了T1或T2信号的显著变化。然而，考虑到基于Fe3+/Fe2+或Cu2+/Cu+介导型磁性生物传感器的磁信号变化有限，Mn7+/Mn2+介导型磁性生物传感器已被证明是检测病原体甚至小分子的一种高灵敏度和可靠的方法。然而，以往的MRS生物传感器主要依赖昂贵的抗体，这限制了其进一步的应用。由于脱氧核糖核酸(DNA)的特异性和稳定性，基于核酸的分析技术提供了对病原体的特异性检测。因此，DNA的高识别效率可以用于病原体检测的DNA生物传感器。基于光学和电化学方法的DNA生物传感器已经成功地检测到各种病原体。然而，大多数DNA生物传感器采用PCR扩增来提高灵敏度，导致检测周期长、成本高。因此，开发一种灵敏度高、准确度高、响应快、操作简单的DNA生物传感器是非常有必要的。因此，将MRS方法与DNA识别相结合，是一种很有前途的食源性致病菌检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测单增李斯特菌的试剂盒，以及一种检测单增李斯特菌的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种检测单增李斯特菌的试剂盒，包含：磁性纳米颗粒(MNPs)修饰的捕获探针，生物素标记的信号探针，碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(ALP-SA)，2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐(AAP)，高锰酸钾等。所述的捕获探针、信号探针能与单增李斯特菌的基因组DNA特异性结合。进一步地，所述的捕获探针、信号探针能与单增李斯特菌的毒力基因hly特异性结合。更进一步的，所述的捕获探针、信号探针的序列为：捕获探针HLY1：5’-CACGAGAGCACCTGGAT-3’；信号探针HLY2：5’-GACAGGAAGAACATCGGG-3’。所述的磁性纳米颗粒(MNPs)修饰的捕获探针为：MNPs-CO-NH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTCACGAGAGCACCTGGAT。所述的生物素标记的信号探针为：GACAGGAAGAACATCGGGTTTTTTTTTTTT-(CH2)7-Biotin。所述的检测单增李斯特菌的试剂盒，还包含：生理盐水柠檬酸钠缓冲液。一种检测单增李斯特菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品的基因组DNA。(2)将磁性纳米颗粒修饰的捕获探针、生物素标记的信号探针、步骤(1)提取的基因组DNA进行热变性处理，热变性处理后加入到生理盐水柠檬酸钠缓冲液中进行孵育使目标DNA与探针杂交，通过磁分离收集磁吸附物1。(3)往步骤(2)得到的磁吸附物1中加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素进行反应使链霉亲和素和生物素连接，通过磁分离收集磁吸附物2。(4)往步骤(3)得到的磁吸附物2中加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐进行反应去除其磷酸基团，通过磁分离收集上清液。(5)往步骤(4)收集的上清液中加入高锰酸钾进行反应将MnO4-还原为Mn2+，反应后通过低场核磁共振(LF-NMR)测量反应混合物的T2值，根据T2值的变化来对单增李斯特菌进行定性、定量检测。进一步地，所述的检测单增李斯特菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品的基因组DNA。(2)将80-120μL的浓度为1mg/mL、修饰量为0.15-0.3nmol/g(捕获探针/磁性纳米颗粒)磁性纳米颗粒修饰的捕获探针、80-120μL的1.5nmol/L生物素标记的信号探针、20-100μL步骤(1)提取的基因组DNA于90-100℃下热变性处理5-10min，热变性处理后加入到100-180μL生理盐水柠檬酸钠缓冲液中于50-60℃下孵育1-1.5h，从而使目标DNA与探针杂交，通过磁分离收集磁吸附物1。(3)往步骤(2)得到的磁吸附物1中加入50-150mL的1μg/mL碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，于36.5-37.5℃下摇动反应0.5-1h使链霉亲和素和生物素连接，通过磁分离收集磁吸附物2。(4)往步骤(3)得到的磁吸附物2中加入50-150μL的25mmol/L2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，于36.5-37.5℃下摇动反应0.5-1h来去除其磷酸基团，通过磁分离收集上清液。(5)往步骤(4)收集的上清液中加入25-75μL的0.5mmol/L高锰酸钾，于常温下反应5-10min，将MnO4-还原为Mn2+后通过低场核磁共振测量反应混合物的T2值，根据T2值的变化来对单增李斯特菌进行定性、定量检测。上述步骤(5)中使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列在35℃采集T2，参数如下：核磁共振频率19.894MHz；90°脉冲宽度，13μs；180°脉冲宽度，26μs；TW＝12000ms；NECH＝12000ms；SW＝100KHz；TE＝1.0ms；NS＝2。对每个点进行三次分析(n＝3)，并且对于每个间隔，使用下式计算T2值的变化(ΔT2)：ΔT2＝|T2样品-T2空白|。本专利技术的原理见图1，主要为：提取的单增李斯特菌的基因组DNA通过热变性处理从双螺旋结构变成单链结构；MNPs-HLY1偶联物和生物素化的HLY本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于：包含：磁性纳米颗粒修饰的捕获探针，生物素标记的信号探针，碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，高锰酸钾。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于：包含：磁性纳米颗粒修饰的捕获探针，生物素标记的信号探针，碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，高锰酸钾。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的捕获探针、信号探针能与单增李斯特菌的基因组DNA特异性结合。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的捕获探针、信号探针能与单增李斯特菌的毒力基因hly特异性结合。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的捕获探针、信号探针的序列为：
捕获探针HLY1：5’-CACGAGAGCACCTGGAT-3’；
信号探针HLY2：5’-GACAGGAAGAACATCGGG-3’。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的磁性纳米颗粒修饰的捕获探针为：MNPs-CO-NH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTCACGAGAGCACCTGGAT；所述的生物素标记的信号探针为：GACAGGAAGAACATCGGGTTTTTTTTTTTT-(CH2)7-Biotin。


6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包含生理盐水柠檬酸钠缓冲液。


7.一种使用权利要求1-6任一项所述的试剂盒检测单增李斯特菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)提取待检样品的基因组DNA；
(2)将磁性纳米颗粒修饰的捕获探针、生物素标记的信号探针、步骤(1)提取的基因组DNA进行热变性处理，热变性处理后加入到生理盐水柠檬酸钠缓冲液中进行孵育使目标DNA与探针杂交，通过磁分离收集磁吸附物1；
(3)往步骤(2)得到的磁吸附物1中加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素进行反应使链霉亲和素和生物素连接，通过磁分离收集磁吸附物2；
(4)往步骤(3)得到的磁吸附物2中加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐进行反应去除其磷酸基团，通过磁分离收集上清液；
(5)往步骤(4)收集的上清液中加入高锰酸钾进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴龙，周书弘，陈翊平，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42