【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于胎儿核酸分析的分子靶标交叉引用本申请要求2018年2月28日提交的美国临时专利申请号62/636,632的权益，该临时申请通过引用全文并入本文。
技术介绍
数字PCR(dPCR)是用于检测和定量核酸靶标的有用方法。使用标记的寡核苷酸探针能够对分区(例如，微滴、微孔)中存在的靶标进行特异性检测。dPCR可用于多种核酸检测方法。
技术实现思路
在一些方面，本文公开了一种用于分析核酸的大小分布的方法，所述方法包括：(A)提供样品，所述样品包括：(i)第一多个核酸和第二多个核酸，其中第一多个核酸各自包含给定长度的第一核酸序列，并且第二多个核酸各自包含比给定长度更长的第二核酸序列；(ii)被配置为扩增第一核酸序列的第一组配对寡核苷酸引物；和(iii)被配置为扩增第二核酸序列的第二组配对寡核苷酸引物；(B)对以下项进行扩增反应：(a)第一核酸序列，以生成第一信号，和(b)第二核酸序列，以生成第二信号；以及(C)确定从第一信号得出的第一值与从第二信号得出的第二值的比率，从而分析大小分布。在一些实施方案中，样品还包括(iv)被配置为与第一核酸序列的区域杂交的第一寡核苷酸探针和(v)被配置为与第二核酸序列的区域杂交的第二寡核苷酸探针。在一些实施方案中，第一信号从第一寡核苷酸探针生成，并且第二信号从第二寡核苷酸探针生成。在一些实施方案中，样品还包括嵌入染料。在一些实施方案中，第一信号或第二信号从嵌入染料生成。在一些实施方案中，第一信号和第二信号从嵌入染料生成。在一些实施方案中，嵌入染料是Green或Eva在一些实施方案中，第一...
【技术保护点】
1.一种用于分析核酸的大小分布的方法，所述方法包括：/n(A)提供样品，所述样品包括：/n(i)第一多个核酸和第二多个核酸，其中所述第一多个核酸各自包含给定长度的第一核酸序列，并且所述第二多个核酸各自包含比所述给定长度更长的第二核酸序列；/n(ii)被配置为扩增所述第一核酸序列的第一组配对扩增寡聚体；/n(iii)被配置为扩增所述第二核酸序列的第二组配对扩增寡聚体；/n(iv)被配置为退火至所述第一核酸序列的区域的第一检测探针；和/n(v)被配置为退火至所述第二核酸序列的区域的第二检测探针；/n(B)对以下项进行扩增反应：(a)所述第一核酸序列，以从所述第一检测探针生成第一信号，和(b)所述第二核酸序列，以从所述第二检测探针生成第二信号；以及/n(C)确定从所述第一信号得出的第一值与从所述第二信号得出的第二值的比率，从而分析所述大小分布。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180228 US 62/636,6321.一种用于分析核酸的大小分布的方法，所述方法包括：
(A)提供样品，所述样品包括：
(i)第一多个核酸和第二多个核酸，其中所述第一多个核酸各自包含给定长度的第一核酸序列，并且所述第二多个核酸各自包含比所述给定长度更长的第二核酸序列；
(ii)被配置为扩增所述第一核酸序列的第一组配对扩增寡聚体；
(iii)被配置为扩增所述第二核酸序列的第二组配对扩增寡聚体；
(iv)被配置为退火至所述第一核酸序列的区域的第一检测探针；和
(v)被配置为退火至所述第二核酸序列的区域的第二检测探针；
(B)对以下项进行扩增反应：(a)所述第一核酸序列，以从所述第一检测探针生成第一信号，和(b)所述第二核酸序列，以从所述第二检测探针生成第二信号；以及
(C)确定从所述第一信号得出的第一值与从所述第二信号得出的第二值的比率，从而分析所述大小分布。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一组配对扩增寡聚体包含：第一正向扩增寡聚体；和第一反向扩增寡聚体。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一组配对扩增寡聚体包含：多个第一正向扩增寡聚体；和多个第一反向扩增寡聚体。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述多个第一正向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述多个第一正向扩增寡聚体中的第一正向扩增寡聚体被配置为与所述第一序列的区域杂交。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述多个第一反向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述多个第一反向扩增寡聚体中的第一反向扩增寡聚体被配置为与所述第一序列的区域杂交。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述第二组配对扩增寡聚体包含：第二正向扩增寡聚体；和第二反向扩增寡聚体。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述第二组配对扩增寡聚体包含：多个第二正向扩增寡聚体；和多个第二反向扩增寡聚体。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述多个第二正向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述多个第二正向扩增寡聚体中的第二正向扩增寡聚体被配置为与所述第二序列的区域杂交。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述多个第二反向扩增寡聚体中的每一个具有不同的核酸序列。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述多个第二反向扩增寡聚体中的第二反向扩增寡聚体被配置为与所述第二序列的区域杂交。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述第一值和所述第二值提供对应于所述样品中所述第一多个核酸和所述第二多个核酸的丰度的定量比率量度。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述第一检测探针或所述第二检测探针包含非靶标杂交序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述第一检测探针或所述第二检测探针是发夹检测探针。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述发夹检测探针是分子信标或分子火炬。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述样品包括：基因组DNA、mRNA、cDNA或其组合。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述样品源自孕妇的血浆。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述样品包括母体核酸和胎儿核酸。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一多个核酸包含所述胎儿核酸，并且其中所述第二多个核酸包含所述母体核酸。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述比率的所述确定提供胎儿级分。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述样品来自患有或疑似患有癌症的个体。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述第一信号和所述第二信号在单个荧光通道中生成。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中(B)在多个分区中的至少一个分区中进行。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述多个分区是多个微滴。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述多个分区是多个孔。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述第二核酸序列包含所述第一核酸序列的至少一部分。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述第二核酸序列包含所述第一核酸序列。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述PCR是定量PCR(qPCR)或数字PCR(dPCR)。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述第一检测探针包含第一可检测标记，并且所述第二检测探针包含第二可检测标记。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述第一检测探针和所述第二检测探针各自进一步包含猝灭剂。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中在所述扩增反应期间，所述第一可检测标记从所述第一检测探针释放，并且所述第二可检测标记从所述第二检测探针释放，从而生成所述第一信号和所述第二信号。
35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述第一可检测标记和所述第二可检测标记各自选自化学发光标记、荧光标记及其任何组合。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述第一信号或所述第二信号是化学发光信号、荧光信号或其任何组合。
37.如权利要求32-36所述的方法，其中所述第一检测探针和所述第二检测探针是检测探针。
38.如权利要求1所述的方法，还包括将所述比率与参考值进行比较。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述比较鉴定所述样品中遗传异常的存在或不存在。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述参考值对应于从第三核酸序列生成的第三值与从第四核酸序列生成的第四值的比率。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述第三核酸序列和所述第四核酸序列各自对应于与所述遗传异常无关的核酸区域。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述参考值由从多个第三核酸序列生成的多个第三值和从多个第四核酸序列生成的多个第四值得出。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述多个第三核酸序列和所述多个第四核酸序列各自对应于与所述遗传异常无关的核酸区域。
44.如权利要求39-43中任一项所述的方法，其中所述遗传异常是胎儿非整倍性。
45.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述第二核酸序列包含所述第一核酸序列的至少一部分。
46.如权利要求1-38中任一项所述的方法，还包括将所述比率与参考值进行比较。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述第一值是所述第一多个核酸的数量。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述第二值是所述第二多个核酸的数量。
49.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中在不定量所述第一多个核酸和所述第二多个核酸的情况下确定所述比率。
50.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述扩增反应包括qPCR，其中所述第一值由所述第一多个核酸的扩增动力学得出。
51.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述扩增反应包括qPCR，其中所述第二值由所述第二多个核酸的扩增动力学得出。
52.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述扩增反应包括dPCR，其中所述第一值由含有所述第一核酸序列的分区的数目得出。
53.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述扩增反应包括dPCR，其中所述第二值由含有所述第二核酸序列的分区的数目得出。
54.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中：
在(A)中，所述样品包括：
(vi)包含一个或多个另外的核酸序列的一种或多种另外的多个核酸；
(vii)被配置为扩增所述一个或多个另外的核酸序列的另外一组或多组配对扩增寡聚体；和
(viii)被配置为退火至所述一个或多个另外的核酸序列的区域的一种或多种另外的检测探针；
在(B)中，对所述一个或多个另外的核酸序列进行所述扩增反应，以从所述另外一组或多组检测探针生成一种或多种另外的信号；以及
在(C)中，确定所述第一值或所述第二值与从所述一种或多种另外的信号得出的一个或多个另外的值的另外的比率，从而分析所述大小分布。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述另外一组或多组配对扩增寡聚体包含n种扩增寡聚体；并且所述另外一组或多组检测探针包含n种另外的检测探针。
56.如权利要求55所述的方法，其中n是1至30之间的整数。
57.如权利要求1所述的方法，其中所述第一值是所述第一多个核酸的数量。
58.如权利要求1所述的方法，其中所述第二值是所述第二多个核酸的数量。
59.如权利要求1所述的方法，其中在不定量所述第一多个核酸和所述第二多个核酸的情况下确定所述比率。
60.一种用于鉴定胎儿非整倍性的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(A)提供样品，所述样品包括：
(i)多个胎儿核酸，每个胎儿核酸包含给定长度的第一核酸序列；
(ii)多个母体核酸，每个母体核酸包含比所述给定长度更长的第二核酸序列；
(iii)被配置为扩增所述第一核酸序列的第一组寡核苷酸引物；
(iv)被配置为扩增所述第二核酸序列的第二组寡核苷酸引物；
(v)被配置为与所述第一核酸序列杂交的第一寡核苷酸探针；
(vi)被配置为与所述第二核酸序列杂交的第二寡核苷酸探针；
(B)扩增(a)所述第一核酸序列，以从所述第一寡核苷酸探针生成第一信号，并且扩增(b)所述第二核酸序列，以从所述第二寡核苷酸探针生成第二信号；
(C)确定从所述第一信号得出的值与从所述第二信号得出的第二值的比率；以及
(D)将所述比率与参考值进行比较，从而鉴定所述胎儿非整倍性的所述存在或不存在。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述第一核酸序列对应于潜在与所述胎儿非整倍性相关的核酸区域。
62.如权利要求6...
【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯多佛·麦克唐纳，
申请(专利权)人：克罗玛科德公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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