用于工程化信号产生的竞争性探针制造技术

一种鉴定第一靶核酸的方法，该方法包括提供包含所述第一靶核酸的样品；提供与所述第一靶核酸具有互补性的第一组成对寡核苷酸，所述第一组成对寡核苷酸包含第一比例的(a)第一竞争性寡核苷酸与(b)包含信号标签的第一信号寡核苷酸，其中所述竞争性寡核苷酸与所述信号寡核苷酸竞争结合所述第一靶核酸；用聚合酶链反应扩增所述第一靶核酸，从而降解所述第一信号寡核苷酸并允许第一信号产生；产生所述第一信号；测量所述第一信号的强度；以及将所述第一信号的强度与所述第一比例相关联，从而鉴定所述第一靶核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于工程化信号产生的竞争性探针交叉引用本申请要求于2016年4月1日提交的美国临时专利申请号62/317,151的权益，该临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。专利技术背景实时PCR是通过记录由嵌入型染料(如SYBRGreen)或靶特异性报告探针在每个循环产生的荧光来监测PCR反应的过程。这通常在实时PCR仪上进行，该PCR仪执行样品的热循环以完成PCR循环，并且在每个循环中的特定点通过一系列激发/发射滤波器组测量每个通道中的样品的荧光。在全基因组测序和高通量分析的时代，需要一次检测多种qPCR靶标的方法。当前qPCR机器的限制是可用于靶标检测的通道数。现代仪器具有2至6个通道，这意味着在每个实验中只能检测到2至6种报告分子。当代多重化技术提供了2至4种不同的荧光报告分子，并且因此在单个反应中可以检测到2至4种靶标。遗憾的是，不同报告分子重叠的荧光信号阻止了将2至4种靶标中的每一种准确地与其他靶标相区分。因此，仍然需要一种可靠且精确的方法用于在多重qPCR反应期间区分多种报告信号。
技术实现思路
实时聚合酶链反应或定量PCR(qPCR)是一种常见的分子生物学技术，其使用荧光报告分子监测反应中靶核酸的指数扩增过程。传统上，所述过程限于在qPCR仪上的每个荧光发射滤波器(颜色通道)仅能区分一种靶标的存在。加州理工学院纳米加工实验室最近取得的进展允许在实时PCR扩增曲线特征(例如振幅和曲线形状)方面使用数学算法来检测每个发射滤波器的多种分析物(2014年9月16日公开的美国专利8,838,394和2015年2月26日公开的美国专利申请公开号US2015-0057178，两者均以其全文并入本文)。对相同颜色通道中的靶标进行“编码”以显示这些扩增曲线特征。编码包括设定颜色通道中每种靶标的强度水平。本文公开了不依赖每种靶标的总探针浓度来调节通过qPCR探针产生的有效相对荧光强度的方法。这是多分析物编码技术的重要改进。本文公开了用于唯一且明确地检测单个颜色检测通道中的多种靶标的方法和组合物。所公开方法的一个方面是通过对每种靶标的任何给定颜色的信号强度(亮度)的比例-度量编码来区分多种靶标的能力以及针对规避简并性的数学策略。当在qPCR仪上的每个可用颜色通道内使用时，所公开的方法显著增加了可检询的靶标测量的数目。本文提供了鉴定第一靶核酸的方法，该方法包括：提供包含所述第一靶核酸的样品；提供与所述第一靶核酸具有互补性的第一组成对寡核苷酸，所述第一组成对寡核苷酸包含第一比例的(a)第一竞争性寡核苷酸与(b)包含第一信号标签的第一信号寡核苷酸，其中所述第一竞争性寡核苷酸与所述第一信号寡核苷酸竞争结合所述第一靶核酸；用聚合酶链反应扩增所述第一靶核酸，从而降解所述第一信号寡核苷酸并允许第一信号产生；产生所述第一信号；测量所述第一信号的强度；以及将所述第一信号的强度与所述第一比例相关联，从而鉴定所述第一靶核酸。在一些方面，所述样品包含第二靶核酸。在一些方面，所述方法进一步包括通过以下方法鉴定所述第二靶核酸：提供与所述第二靶核酸具有互补性的第二组成对寡核苷酸，所述第二组成对寡核苷酸包含第二比例的(a)第二竞争性寡核苷酸与(b)包含第二信号标签的第二信号寡核苷酸，其中所述第二竞争性寡核苷酸与所述第二信号寡核苷酸竞争结合所述第二靶核酸；用聚合酶链反应扩增第二靶序列，从而降解所述第二信号寡核苷酸并允许第二信号产生；产生所述第二信号；测量所述第二信号的强度；以及将所述第二信号的强度与所述第二比例相关联，从而鉴定所述第二靶核酸。在一些方面，所述第一信号寡核苷酸和所述第二信号寡核苷酸包含相同的信号标签。在一些方面，所述第一靶核酸和所述第二靶核酸由在相同的聚合酶链反应中产生的不同的信号强度来鉴定。在一些方面，所述第一信号强度与所述第二信号强度不同。在一些方面，所述成对寡核苷酸包含qPCR探针。在一些方面，所述信号寡核苷酸包含信号标签和信号猝灭标签。在一些方面，所述信号标签包含荧光团。在一些方面，所述信号猝灭标签阻断与所述信号标签相对应的信号的产生，直到所述信号猝灭标签在聚合酶链反应期间通过寡核苷酸降解与所述信号标签分离，从而允许所述信号产生。在一些方面，产生所述信号包括激发所述信号标签。在一些方面，激发包括在所述信号标签处引导光照、电磁辐射和从能源发射的能量中的至少一种。在一些方面，所述竞争性寡核苷酸不包含信号标签。在一些方面，所述竞争性寡核苷酸包含至少一个修饰末端。在一些方面，所述修饰末端阻止在扩增期间的酶促延伸。在一些方面，所述修饰末端包含缺少羟基的3’端。在一些方面，所述修饰末端包含缺少磷酸基团的5’端。在一些方面，所述修饰末端包含5’加帽端。在一些方面，所述修饰末端包含3’加帽端。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:1。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:2。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:3。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:4。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:5。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:6。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:7。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:8。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:9。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:10。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:16。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:20。在一些方面，所述成对寡核苷酸仅包含信号寡核苷酸或仅包含竞争性寡核苷酸。在一些方面，所述第一组成对寡核苷酸的总浓度与所述第二组成对寡核苷酸的总浓度相同。在一些方面，所述方法进一步包括：使用至多30组成对寡核苷酸鉴定至多30种靶核酸序列，其中每组成对寡核苷酸与所述至多30种靶核酸序列中的一种具有互补性，其中所述至多30组成对寡核苷酸中的每组均包含独特比例的(a)竞争性寡核苷酸与(b)包含信号标签的信号寡核苷酸，其中每组内的竞争性寡核苷酸与同一组内的信号寡核苷酸竞争结合相应的靶核酸序列；用聚合酶链反应扩增所述至多30种靶核酸序列，从而降解所述信号寡核苷酸并允许至多30个信号产生；产生至多30个信号；测量所述至多30个信号的强度；以及将所述至多30个信号的强度与所述至多30个比例相关联，从而鉴定所述至多30种靶核酸序列。在一些方面，所述至多30组成对寡核苷酸中每一组内的信号寡核苷酸的信号标签是相同的。在一些方面，所述至多30种靶核酸序列由在相同的聚合酶链反应中产生的信号强度来鉴定。在一些方面，所述至多30个比例中的每一个比例与所述至多30个比例中的所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定第一靶核酸的方法，该方法包括，提供包含所述第一靶核酸的样品，提供与所述第一靶核酸具有互补性的第一组成对寡核苷酸，所述第一组成对寡核苷酸包含第一比例的(a)第一竞争性寡核苷酸与(b)包含第一信号标签的第一信号寡核苷酸，其中所述第一竞争性寡核苷酸与所述第一信号寡核苷酸竞争结合所述第一靶核酸，用聚合酶链反应扩增所述第一靶核酸，从而降解所述第一信号寡核苷酸并允许第一信号产生，产生所述第一信号，测量所述第一信号的强度，以及将所述第一信号的强度与所述第一比例相关联，从而鉴定所述第一靶核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.01 US 62/317,1511.一种鉴定第一靶核酸的方法，该方法包括，提供包含所述第一靶核酸的样品，提供与所述第一靶核酸具有互补性的第一组成对寡核苷酸，所述第一组成对寡核苷酸包含第一比例的(a)第一竞争性寡核苷酸与(b)包含第一信号标签的第一信号寡核苷酸，其中所述第一竞争性寡核苷酸与所述第一信号寡核苷酸竞争结合所述第一靶核酸，用聚合酶链反应扩增所述第一靶核酸，从而降解所述第一信号寡核苷酸并允许第一信号产生，产生所述第一信号，测量所述第一信号的强度，以及将所述第一信号的强度与所述第一比例相关联，从而鉴定所述第一靶核酸。2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含第二靶核酸。3.如权利要求2所述的方法，进一步包括通过以下方法鉴定所述第二靶核酸：提供与所述第二靶核酸具有互补性的第二组成对寡核苷酸，所述第二组成对寡核苷酸包含第二比例的(a)第二竞争性寡核苷酸与(b)包含第二信号标签的第二信号寡核苷酸，其中所述第二竞争性寡核苷酸与所述第二信号寡核苷酸竞争结合所述第二靶核酸，用聚合酶链反应扩增第二靶序列，从而降解所述第二信号寡核苷酸并允许第二信号产生，产生所述第二信号，测量所述第二信号的强度，以及将所述第二信号的强度与所述第二比例相关联，从而鉴定所述第二靶核酸。4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一信号寡核苷酸和所述第二信号寡核苷酸包含相同的信号标签。5.如权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述第一靶核酸和所述第二靶核酸由在相同的聚合酶链反应中产生的不同的信号强度来鉴定。6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述第一信号强度与所述第二信号强度不同。7.如权利要求1所述的方法，其中所述成对寡核苷酸包含qPCR探针。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述信号寡核苷酸包含信号标签和信号猝灭标签。9.如权利要求8所述的方法，其中所述信号标签包含荧光团。10.如权利要求8-9中任一项所述的方法，其中所述信号猝灭标签阻断与所述信号标签相对应的信号的产生，直到所述信号猝灭标签在聚合酶链反应期间通过寡核苷酸降解与所述信号标签分离，从而允许所述信号产生。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中产生所述信号包括激发所述信号标签。12.如权利要求11所述的方法，其中激发包括在所述信号标签处引导光照、电磁辐射和从能源发射的能量中的至少一种。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述竞争性寡核苷酸不包含信号标签。14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述竞争性寡核苷酸包含至少一个修饰末端。15.如权利要求14所述的方法，其中所述修饰末端阻止在扩增期间的酶促延伸。16.如权利要求15所述的方法，其中所述修饰末端包含缺少羟基的3’端。17.如权利要求15所述的方法，其中所述修饰末端包含缺少磷酸基团的5’端。18.如权利要求15所述的方法，其中所述修饰末端包含5’加帽端。19.如权利要求15所述的方法，其中所述修饰末端包含3’加帽端。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:1。21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:2。22.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:3。23.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:4。24.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:5。25.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:6。26.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:7。27.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:8。28.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:9。29.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:10。30.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:16。31.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:20。32.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述成对寡核苷酸仅包含信号寡核苷酸或仅包含竞争性寡核苷酸。33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述第一组成对寡核苷酸的总浓度与所述第二组成对寡核苷酸的总浓度相同。34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，进一步包括使用至多30组成对寡核苷酸鉴定至多30种靶核酸序列，其中每组成对寡核苷酸与所述至多30种靶核酸序列中的一种具有互补性，其中所述至多30组成对寡核苷酸中的每组均包含独特比例的(a)竞争性寡核苷酸与(b)包含信号标签的信号寡核苷酸，其中每组内的竞争性寡核苷酸与同一组内的信号寡核苷酸竞争结合相应的靶核酸序列，用聚合酶链反应扩增所述至多30种靶核酸序列，从而降解所述信号寡核苷酸并允许至多30个信号产生，产生至多30个信号，测量所述至多30个信号的强度，以及将所述至多30个信号的强度与所述至多30个比例相关联，从而鉴定所述至多30种靶核酸序列。35.如权利要求34所述的方法，其中所述至多30组成对寡核苷酸中每一组内的信号寡核苷酸的信号标签是相同的。36.如权利要求34-35中任一项所述的方法，其中所述至多30种靶核酸序列由在相同的聚合酶链反应中产生的信号强度来鉴定。37.如权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述至多30个比例中的每一个比例与所述至多30个比例中的所有其他比例均不同。38.如权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述至多30个信号强度中的每一个信号强度与所述至多30个信号强度中的所有其他信号强度均不同。39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述聚合酶链反应通过使用具有5’至3’外切核酸酶活性的核酸聚合酶、外切聚合酶或分子信标进行。40.如权利要求34-39中任一项所述的方法，其中在单个荧光通道中测量至多五个信号。41.如权利要求34-40中任一项所述的方法，其中至多五组成对寡核苷酸中的每组的总浓度相同。42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述反应中的分子总数保持不变。43.一种组合物，其包含：与第一靶核酸具有互补性的第一组成对寡核苷酸，所述第一组成对寡核苷酸包含第一比例的(a)竞争性寡核苷酸与(b)包含信号标签的信号寡核苷酸，其中所述竞争性寡核苷酸被配置为在用聚合酶链反应扩增所述第一靶核酸期间与所述信号寡核苷酸竞争结合所述第一靶核酸，其中所述信号寡核苷酸被适配为当在聚合酶链反应期间被核酸聚合酶降解并被能源激发时产生具有第一强度的第一信号，并且其中所述第一强度与所述第一比例相关联。44.一种鉴定第一靶分子的方法，该方法包括，提供包含所述第一靶分子的样品，提供结合所述第一靶分子的第一组成对捕获分子，所述第一组成对捕获分子包含第一比例的(a)第一竞争性捕获分子与(b)包含信号标签的第一信号捕获分子，其中所述竞争性捕获分子与所述信号捕获分子竞争结合所述第一靶分子，产生所述第一信号，测量所述第一信号的强度，以及将所述第一信号的强度与所述第一比例相关联，从而鉴定所述第一靶分子。45.如权利要求44所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕西安·A·E·杰基，阿迪蒂亚·拉贾戈帕，卡伦·L·门格，格雷戈里·戈施，
申请(专利权)人：克罗玛科德公司，
类型：发明
国别省市：美国,US