一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术制造技术

本发明专利技术属于医学检测领域，具体涉及一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术。本发明专利技术公开了提供一种用于极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术及试剂盒体系，突破目前定量PCR的技术局限，达到每个反应中1copies病毒检测灵敏度极限，即1拷贝病毒检测灵敏度的理论值100％。从而适合便于适合病原微生物普筛，特别是病毒的大规模筛查中对超高灵敏的要求。

【技术实现步骤摘要】
一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术
本专利技术属于生物诊断领域，具体涉及一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术。
技术介绍
感染性疾病是临床常见的多发病，是全球死亡率和发病率最高的疾病之一。广义的感染性疾病包括所有病原微生物感染引起的疾病。这些病原微生物以病毒和细菌为代表，主要包括立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊病毒、寄生虫等物质。相对于免疫检测技术来说，基于荧光探针的定量PCR技术具有高灵敏高特异的特征，广泛应用于病原微生物的的检测，如丙肝、乙肝、HIV、SRAS-CoV-2等病毒检测。但是当用于检测极低载量病毒尤其是个位数拷贝病毒时，对酶和引物/探针的敏感度要求极高，极易产生核酸检测假阴性，是当前核酸检测技术的一个难题。如在SARS-CoV-2的检测NallaAK等【1】报道采用ThermoFisher公司高性能酶体系筛选出最优引物探针组合，每反应6.3拷贝最高灵敏度为90％(理论值：100％)，每反应0.63拷贝是灵敏度仅为15％(理论值：63％)；同时采用华大基因(BGI)试剂盒测试每反应6.3拷贝灵敏度仅为50％(理论值：100％)，每反应0.63拷贝是灵敏度为0。能将每反应1拷贝的检测灵敏度提高到接近理论值100％是目前定量PCR技术的极限，也是目前国际上尚未解决的技术瓶颈。【1】NallaAK,CastoAM,HuangMLW,etal.ComparativePerformanceofSARS-CoV-2DetectionAssaysusingSevenDifferentPrimer/ProbeSetsandOneAssayKit[J].JournalofClinicalMicrobiology,2020,58(6).多重qPCR是指在同一PCR反应体系里加上两对以上引物及各自探针，每对引物探针分别对应一个qPCR荧光通道，从而扩增不同的基因或靶标，但是多重qPCR因探针引物的相互干扰容易降低检测的灵敏度，同时依赖于昂贵的多通道仪器。如SRAS-CoV-2的核酸检测试剂盒多重试剂的灵敏度普遍低于单重灵敏度。基于多重PCR发展的利用多重探针扩增(MultiplexProbeAmplification，MPA)的专利技术很好地克服了RT-PCR多重检测的限制，突破荧光PCR仪通道数的瓶颈，可允许每个荧光通道分别检测多达六个不同的靶标，从而可以实现在一个PCR反应管中实现多靶标(18重)同时检测。多重PCR和多重探针扩增虽然解决的多靶标问题用于多种病毒同时检测或基因分型检测，但均不适合大规模病毒筛查中对超高灵敏的要求，尤其如SRAS-CoV-2等具有病毒载量很低且传染性极强的病毒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术及试剂盒体系，突破目前定量PCR的技术局限，达到每个反应中1copies病毒检测灵敏度极限，即1拷贝病毒检测灵敏度的理论值100％。从而适合便于适合病原微生物普筛，特别是病毒的大规模筛查中对超高灵敏的要求。一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术，其包含以下步骤：a.依据已公开的种病原微生物基因序列，选取2个以上目标扩增区域序列，设计2对以上的特异性引物对和探针，所述探针为同一波长荧光基团标记，所述目标扩增区域序列为该病原微生物的特异性基因序列，且目标扩增区域序列不重叠；b.采集样品，用样品直接扩增或核酸提取或富集或一步法裂解得到扩增用DNA或RNA模板；c.采用上述多对特异性引物对和探针，以上述样品或核酸为模板，进行PCR扩增；本专利技术技术原理：在多重PCR技术的基础上，使用某种病原微生物的基因序列设计多对引物和探针进行扩增检测，所有扩增子(目标扩增区域或目标扩增片段)的探针标记采用同一波长荧光基团标记。这样使得PCR或RT-qPCR扩增过程增加了扩增子的理论拷贝数，在PCR扩增过程中多个片段扩增荧光信号叠加，使得Ct值降低荧光信号值提高，从而大大提高了病原微生物检测的灵敏度，通过此技术可使最低1个拷贝病原微生物检测灵敏度提高到极限理论值100％。该技术命名为单色信号叠加多重qPCR技术(MonochromeSignalSuperpositionMultiplexqPCR，MSSMqPCR)，简称(原理如图1)，特别适合如SRAS-CoV-2等低载量病毒的大规模筛查。同时若通过每个病毒设计多个扩增子的引物探针，实现多通道同时超高灵敏检测多种病毒靶标，如HIV、HBV、HIV的血源病毒筛查。在另一优选例中，所述极低载量为每1ml中病原微生物拷贝数50以下样品；本技术仅涉及定量PCR步骤，是指每个反应体系中最低仅含1拷贝病毒的极限值。在另一优选例中，所述病原微生物指寄生虫、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒，其中优选为病毒。在另一优选例中，所述特异性引物对可包括2-50个引物对或2-30个引物对，较佳地2-10对，更佳地2-6个引物对。在另一优选例中，所述探针类型不限于水解探针，分子信标等特异性荧光探针标记，优选水解探针。所述探针的5’端标记的荧光基团为选自FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记的淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。在一个具体的实施方案中，本专利技术所述探针的5’端标记的荧光基团为FAM，所述探针的3’端标记的淬灭基团为相同基团或不同基团。在另一优选例中，所述荧光水解探针数量可包括2-50条，较佳地2-10条，更佳地2-6条探针。在另一优选例中，所述病原微生物的核酸包括RNA或DNA，优选RNA病毒或DNA病毒。在另一优选例中，所述检测病原微生物的种类不同通道荧光探针标记，可实现同时检测1-20个病原生物单管联合检测，优选检测病毒数量为1-6个。在另一优选例中，PCR扩增的反应体系包括单酶法或双酶法RT-qPCRRNA病毒检测；或使用qPCR进行DNA病毒检测。在另一优选例中，所述RT-qPCR或qPCR包含的酶种类不限于DNA聚合酶，野生或改造的TaqDNA聚合酶、野生或改造的TthDNA聚合酶、野生或改造的MMLV、AMV等反转录酶；UNG酶和Rnase酶抑制剂。在本专利技术的第二方面，提供一种基于定量PCR技术的极低载量病原微生物超灵敏检测核酸检测试剂盒，所述试剂盒包含：特异性扩增多种靶序列的2对以上引物对和探针，所述探针为同一荧光波长染料标记，每类引物对和探针可分别独立包装或混合包装；以及聚合酶链式反应其他试剂或成分和使用说明书，其中内标基因的探针荧光应在不同于检测病原微生物的探针波长。在另一优选例中，所述病原微生物指寄生虫、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒，其中优选为病毒。在另一优选例中，所述特异性引物对可包括2-50个引物对或2-30个引物对，较佳地2-10对，更佳地2-6个引物对。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术，其包含以下步骤：/na.依据已公开的同一目的病原微生物基因序列，选取2个以上目标扩增区域序列，设计2对以上的特异性引物对和探针，所述探针为同一波长荧光基团标记，所述目标扩增区域序列为该病原微生物的特异性基因序列，且目标扩增区域序列不重叠；/nb.采集样品，抽提核酸；/nc.采用步骤a所述特异性引物对和探针，以上述样品核酸为模板，进行PCR扩增；/n同时，模板可为样品采集液或样品采集裂解液。/n

【技术特征摘要】
1.一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术，其包含以下步骤：
a.依据已公开的同一目的病原微生物基因序列，选取2个以上目标扩增区域序列，设计2对以上的特异性引物对和探针，所述探针为同一波长荧光基团标记，所述目标扩增区域序列为该病原微生物的特异性基因序列，且目标扩增区域序列不重叠；
b.采集样品，抽提核酸；
c.采用步骤a所述特异性引物对和探针，以上述样品核酸为模板，进行PCR扩增；
同时，模板可为样品采集液或样品采集裂解液。


2.如权利要求1所述的超灵敏定量PCR检测技术，其特征在于所述探针的5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的一种。


3.如权利要求2所述的超灵敏定量PCR检测技术，其特征在于所述探针的所述探针的3’端标记的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。


4.如权利要求1所述的超灵敏定量PCR检测技术，其特征在于所述病原微生物为寄生虫、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、或病...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继国，田晓峰，陈普，
申请(专利权)人：天筛上海科技有限公司，天罗诊断科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31