一种鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒制造技术

本实用新型专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种鸡IRS1基因荧光定量RT‑PCR试剂盒，包括盒体(1)，盒体(1)内设有DNA双链嵌合绿色染料热启动荧光PCR混合物(2)、鸡IRS1基因表达的特异性正反向引物(3)、定量PCR参比染料(4)、鸡内参基因GAPDH表达的特异性正反向引物(5)、灭菌无核酸酶水(6)、稀释缓冲液(7)。本实用新型专利技术试剂盒准确性高、快速、价格低廉，通过建立实时荧光定量RT‑PCR技术检测鸡IRS1基因表达的方法，为研究鸡IRS1表达调控以及肌肉生长发育调控奠定基础，为优质鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒
本技术属于生物
，尤其涉及鸡IRS1基因表达荧光定量RT-PCR试剂盒，主要用于鸡IRS1基因在肌肉和肝脏代谢、生长、分化中的作用机理研究。
技术介绍
胰岛素受体底物1(insulinreceptorsubstrate1，IRS1)是Insulin/IGF1信号通路的关键节点的重要代表。IRS1能够将IGF1受体的信号传递给细胞内PI3K/Akt和MAPK/Erk信号通路，在骨骼肌生长发育，葡萄糖元摄取和合成方面具有重要的作用。在肝脏中，IRS1介导胰岛素非依赖性调节糖脂代谢，对饲喂后期的信号传导非常重要。肉鸡是动物蛋白的重要来源之一，胸肌和腿肌骨骼肌的生长发育直接影响鸡上市后产肉量的高低。因此，研究鸡肝脏和肌肉中IRS1的作用机理对于优质鸡育种具有重要作用。实时荧光定量PCR技术是生命科学领域的一项重要技术，是快速检测基因表达水平的首选方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃，使定量极微量的基因表达成为可能，能够广泛用于基因表达、基因功能等方面。
技术实现思路
本技术的目的是提供一种鸡IRS1基因表达荧光定量RT-PCR试剂盒，本技术试剂盒准确性高、快速、价格低廉，通过建立实时荧光定量RT-PCR技术检测鸡IRS1基因表达，为研究鸡IRS1表达调控以及肌肉生长发育调控奠定基础，为优质鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值。本技术的目的是通过以下技术方案实现的，一种鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括盒体，盒体内设有DNA双链嵌合绿色染料(SYBRGreenMaster)启动荧光PCR混合物、鸡IRS1基因表达的特异性正反向引物、鸡内参基因GAPDH表达的特异性正反向引物、定量PCR参比染料(ROX)、灭菌无核酸酶水(DEPC)、稀释缓冲液(Dilutionbuffer)。其中，鸡IRS1基因正反向引物序列为：F:5，—CTACCGCCTGTGCCTGACTAAC—3，R:5，—CGTCCCACCTCGATGAAGAAG—3；以及鸡内参基因GAPDH表达的特异性正反向引物序列为:F:5，—CGATCTGAACTACATGGTTTAC—3，R:5,—TCTGCCCATTTGATGTTGC—3。优选的，所述盒体内设有缓冲带，缓冲带内侧壁上设有六个弹性口袋，弹性口袋沿缓冲带宽度方向设置，弹性口袋中放置试剂。优选的，所述缓冲带为可折叠结构，缓冲带可折叠成口字型结构，缓冲带可展开成一字型结构。优选的，所述六个弹性口袋中，三个弹性口袋组成一组，六个弹性口袋分成两组；缓冲带折叠时，两组弹性口袋相对设置。上述鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒的使用方法如下：(1)组织RNA的抽提与纯化：从鸡肌肉和肝脏组织中提取总RNA并纯化，用稀释缓冲液(Dilutionbuffer)将RNA稀释为同一浓度；(2)cDNA第一链的合成：以步骤(1)中稀释后的RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；(3)实时荧光定量PCR(realtimePCR)扩增反应：采用DNA双链嵌合绿色荧光染料法(SYBRGreen)，以上述步骤(1)设计的IRS1正反向引物和GAPDH基因正反向引物和步骤(2)合成的cDNA第一链为模板，在荧光定量PCR仪上进行；本技术所述步骤(3)中实时荧光定量PCR(realtimePCR)扩增的反应条件设置如下：95℃预变性15min；然后40个循环的95℃变性10s,退火60℃30s。鸡组织样本经反转录成cDNA第一链后，对IRS1和GAPDH基因基因按照设定好的条件同时进行实时荧光定量PCR(realtimePCR)反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以GAPDH基因为内参照，对IRS1基因mRNA表达水平进行校正，并采用2-ΔΔCT法对数据进行处理，计算IRS1基因相对表达量。与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：第一，本技术利用IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒进行检测，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、污染少，操作方便等优点。第二，本技术将试剂盒内的试剂直接设计在缓冲带内侧，通过弹性口袋的弹性力，将试剂压紧在弹性口袋内，防止试剂瓶在盒体内发生晃动。缓冲带具有两个作用，一个是安置试剂瓶，另一个是作为盒体的缓冲材料，防止运输过程中发生磕碰。弹性带的作用也有二，一是存放试剂瓶，二是当缓冲带折叠时，弹性口袋亦可作为试剂瓶之间的换成材料，防止试剂瓶之间发生摩擦。附图说明图1是本技术鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒的缓冲带结构示意图(缓冲带展开)；图2是本技术鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒的缓冲带结构示意图(缓冲带折叠)；图3是本技术鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒的整体结构示意图；图1-3中：包括盒盖1、DNA双链嵌合绿色染料(SYBRGreenMaster)热启动荧光PCR混合物2、鸡IRS1基因表达的特异性正反向引物3、定量PCR参比染料(Rox)4、鸡内参基因GAPDH表达的特异性正反向引物5、灭菌无核酸酶水(DEPC)6、稀释缓冲液(Dilutionbuffer)7；图4是本技术IRS1基因在鸡不同发育时期肝脏组织中的差异表达量；图4中，不同小写字母表示IRS1基因在同一品种不同发育时期肝脏组织中表达量差异显著P＜0.05)；*表示IRS1基因在同一发育时期在不同品种肝脏组织中表达量差异显著P＜0.05，**表示IRS1基因在同一发育时期在不同品种肝脏组织中表达量差异极显著P＜0.01。图5是本技术IRS1基因在鸡不同发育时期肌肉组织中的差异表达量；图5中，不同小写字母表示IRS1基因在同一品种鸡不同发育时期肌肉组织中表达量差异显著P＜0.05)；*表示IRS1基因在同一发育时期在不同品种肌肉组织中表达量差异显著P＜0.05，**表示IRS1基因在同一发育时期在不同品种肌肉组织中表达量差异极显著P＜0.01。具体实施方式结合具体实施例和附图对本技术作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本技术范围。实施例1鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒如图1-3所示，一种鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒，包括盒体1，盒体1内设有缓冲带8，缓冲带8内侧壁上设有六个弹性口袋9，弹性口袋9沿缓冲带8宽度方向设置。六个弹性口袋9中分别放置DNA双链嵌合绿色染料(SYBRGreenMaster)热启动荧光PCR混合物2、鸡IRS1基因表达的特异性正反向引物3、定量PCR参比染料(ROX)4、鸡内参基因GAPDH表达的特异性正反向引物5、灭菌无核酸酶水(DEPC)6、稀释缓冲液(Dilutionbuffer)7。其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括盒体(1)，盒体(1)内设有DNA双链嵌合绿色染料SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物(2)、鸡IRS1基因表达的特异性正反向引物(3)、定量PCR参比染料(4)、鸡内参基因GAPDH表达的特异性正反向引物(5)、灭菌无核酸酶水(6)、稀释缓冲液(7)。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括盒体(1)，盒体(1)内设有DNA双链嵌合绿色染料SYBRGreenMaster热启动荧光PCR混合物(2)、鸡IRS1基因表达的特异性正反向引物(3)、定量PCR参比染料(4)、鸡内参基因GAPDH表达的特异性正反向引物(5)、灭菌无核酸酶水(6)、稀释缓冲液(7)。


2.根据权利要求1所述的鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述鸡IRS1基因表达的特异性正反向引物(3)序列为：
F:5，—CTACCGCCTGTGCCTGACTAAC—3，
R:5，—CGTCCCACCTCGATGAAGAAG—3；
所述鸡内参基因GAPDH表达的特异性正反向引物(5)序列为:
F:5，—CGATCTGAACTACATGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：章明，姬改革，束婧婷，单艳菊，巨晓军，刘一帆，屠云洁，邹剑敏，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：新型
国别省市：江苏;32