精子端粒长度测量试剂盒与应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种精子端粒长度测量试剂盒与应用。精子端粒长度测量试剂盒，包括：1)DNA上游引物telg：2)DNA下游引物telc；3)DNA正向引物B2M‑F；4)DNA反向引物B2M‑R；5)B2M Cy5荧光探针。本发明专利技术还公开了精子端粒长度测量试剂盒在预测精子质量上的应用。本发明专利技术公开的精子端粒长度测量试剂盒与应用具有以下有益效果：1、试剂盒通过对精子端粒长度的测量，鉴定精子质量，为临床干预性治疗提供一个高效和准确的检测手段；2、检测精度高且检测速度快；3、将精子端粒长度测定应用于辅助生育领域。

【技术实现步骤摘要】
精子端粒长度测量试剂盒与应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种精子端粒长度测量试剂盒与应用。
技术介绍
大量科学研究证明，造成不孕不育、流产、部分婴儿先天性疾病的最重要原因是生殖细胞老化，尤其是生殖细胞所含染色体DNA的老化。除了随着年龄增长的自然老化以外，环境污染、食品污染、精神压力和不良生活习惯也会加剧DNA老化。目前对精子生育力的检测主要限于在显微镜下检测精子数量和活跃性，以及细胞形态，但无法检测到分子层面，特别是遗传物质(DNA)的缺陷、尤其是老化程度。而这种遗传物质(DNA)的缺陷是导致精子生育力下降的决定因素。因此，如何在分子层面对精子老化程度进行检测，成为急需解决的问题。端粒是包裹在染色体DNA两端的质粒，因其长度与细胞的寿命线性相关，端粒长度被认为是判断细胞生理年龄的生物标记物。研究成果显示，精子细胞的端粒长度与其生育力正相关，端粒缩短的精子不孕率及胚胎流产率都显著上升。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本专利技术的第一个目的在于公开精子端粒长度测量试剂盒。本专利技术第二个目的在于公开此试剂盒在预测精子生育力上的应用。本专利技术公开的试剂盒，通过对精子端粒长度的测量，鉴定精子质量，为临床干预性治疗提供一个高效和准确的检测手段。技术方案：精子端粒长度测量试剂盒，包括：1)DNA上游引物telg：2)DNA下游引物telc；3)DNA正向引物B2M-F；4)DNA反向引物B2M-R；5)B2MCy5荧光探针，其中：DNA引物以及B2MCy5荧光探针的序列如下：进一步地，还包括：6)荧光底物EvaGreen；7)Qiagen多通道PCR2倍混合物；8)正常人全血DNA；9)无核酸水解酶水。更进一步地，正常人全血DNA是通过50个正常人全血DNA纯化后混合，Nanodrop定量后而得。进一步地，测量相对平均端粒长度时，反应体如下：上述的任意一项所述的精子端粒长度测量试剂盒在预测精子质量上的应用。更进一步地，将被检人员的精子的端粒长度值将和正常人群精子的标准曲线比较，从而得到被检人员精子的端粒年龄，若被检人员精子的端粒年龄高于45岁，则认为精子质量偏低。基于如下原因，本申请公开的精子端粒长度测量试剂盒及其应用可对精子质量做出准确的预测：1.个人的实际年龄并不能准确地反应一个人的衰老程度：大量研究表明端粒长度和个人的衰老程度及其相关。因此，端粒长度能更准确地反应一个人的生理衰老程度和生理年龄。我们在此称之为“端粒年龄”。2.衰老是不孕不育的最重要的因素之一。端粒缩短引起生殖细胞，特别是精子细胞的生育力下降甚至衰亡，从而导致不孕和流产可能性的增加。因此，对精子细胞端粒长度的测量可对精子质量作出准确预测，对临床工作具有指导意义。有益效果：本专利技术公开的精子端粒长度测量试剂盒与应用具有以下有益效果：1、试剂盒通过对精子端粒长度的测量，鉴定精子质量，为临床干预性治疗提供一个高效和准确的检测手段；2、检测精度高且检测速度快；3、将精子端粒长度测定应用于辅助生育领域。附图说明图1为本专利技术公开的精子端粒长度测量试剂盒的示意图。具体实施方式：下面对本专利技术的具体实施方式详细说明。如图1所示，精子端粒长度测量试剂盒，包括：1)DNA上游引物telg：2)DNA下游引物telc；3)DNA正向引物B2M-F；4)DNA反向引物B2M-R；5)B2MCy5荧光探针，其中：DNA引物以及B2MCy5荧光探针的序列如下：序列DNA上游引物telg5’-ACACCTCCTCCATGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTG-3’DNA下游引物telc5’-TGTTAGCGACGCGATATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA-3’DNA正向引物B2M-F5’-CCAGCAGAGAATGGAAAGTCAA-3’DNA反向引物B2M-R5’-TCTCTCTCCATTCTTCAGTAAGTCAACT-3’B2MCy5探针5’-/5Cy5/ATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACA/3IAbRQSp/-3’进一步地，还包括：6)荧光底物EvaGreen；7)Qiagen多通道PCR2倍混合物；8)正常人全血DNA；9)无核酸水解酶水。更进一步地，正常人全血DNA是通过50个正常人全血DNA纯化后混合，Nanodrop定量后而得。进一步地，测量相对平均端粒长度时，反应体如下：应用上述试剂盒测量人体精子的端粒长度，包括以下步骤：步骤(1)、从精液样品提取DNA:50-250微升精液用于DNA的提取；使用QiagenQIAampDNA抽提试剂盒(产品编号51304)提取精液中基因组DNA，以0.8％琼脂糖凝胶电泳确定DNA质量和Nanodrop确定DNA浓度；步骤(2)、定量PCR反应:PCR反应在96孔板进行，每孔定量PCR反应(10微升)包括：1)纯化的血液DNA样品(2纳克,1微升)2)DNA上游引物telg(每个300纳摩，0.5微升)3)DNA下游引物telc(每个300纳摩，0.5微升)4)DNA正向引物B2M-F(300纳摩,0.5微升)5)DNA反向引物B2M-R(300纳摩,0.5微升)6)B2MCy5探针引物(100纳摩,0.5微升)7)荧光底物：EvaGreen(0.5微升)8)多通道PCR2倍混合物(5微升)9)无核酸水解酶水(1微升)每个96孔板PCR反应包括无DNA模版对照(NTC)；每个96孔板PCR反应也包括标准曲线反应：试剂盒中正常人全血DNA(试管8)用无核酸水解酶水稀释成以下不同大小的浓度：4纳克/微升；2纳克/微升；1纳克/微升；0.5纳克/微升；0.25纳克/微升；0.125纳克/微升；0.0625纳克/微升；0.0313纳克/微升；被检测样品一式三份点样。PCR反应将在罗氏LightCycler480II进行。PCR反应程序如下：表2:定量PCR反应程序步骤(3)相对平均端粒长度(rATL)值的确定：PCR反应完成后，根据PCR仪的内在程序确定每个反应的Ct值，同时建立端粒(T)和单份基因B2M(S)的Ct和DNA量的标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.精子端粒长度测量试剂盒，其特征在于，包括：/n1)DNA上游引物telg：/n2)DNA下游引物telc；/n3)DNA正向引物B2M-F；/n4)DNA反向引物B2M-R；/n5)B2M Cy5荧光探针，其中：/nDNA引物以及B2M Cy5荧光探针的序列如下：/n

【技术特征摘要】
1.精子端粒长度测量试剂盒，其特征在于，包括：
1)DNA上游引物telg：
2)DNA下游引物telc；
3)DNA正向引物B2M-F；
4)DNA反向引物B2M-R；
5)B2MCy5荧光探针，其中：
DNA引物以及B2MCy5荧光探针的序列如下：









序列


DNA上游引物telg
5’-ACACCTCCTCCATGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTG-3’


DNA下游引物telc
5’-TGTTAGCGACGCGATATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA-3’


DNA正向引物B2M-F
5’-CCAGCAGAGAATGGAAAGTCAA-3’


DNA反向引物B2M-R
5’-TCTCTCTCCATTCTTCAGTAAGTCAACT-3’


B2MCy5探针
5’-/5Cy5/ATG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓薇，李红林，
申请(专利权)人：山东端泉健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37