荧光定量的指标确定方法技术

本发明专利技术提供了一种荧光定量的指标确定方法，涉及荧光定量检测技术领域，包括采集第一数量个循环对应的初始荧光定量PCR扩增数据；对第一数量中前第二数量个循环对应的初始PCR扩增数据进行线性拟合，确定扩增曲线基线；对初始PCR扩增数据去基线，得到目标PCR扩增数据；基于第一数量中除前第二数量以外的后第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据确定PCR的指标。在原始荧光强度的基础上消除基线，从而去除其影响，计算简便，容易实现且精度高。

【技术实现步骤摘要】
荧光定量的指标确定方法
本专利技术涉及荧光定量检测
，尤其是涉及一种荧光定量的指标确定方法。
技术介绍
目前，诊断传染病标准的核酸定量方法仍然多采用荧光实时定量PCR，其能够量化样品模板的初始值，常被用在基因分析表达、转基因食物检测和癌症检测中。它通常依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，但基于标准曲线的方法需要满足一个苛刻的假设条件，即在所有样本中，每个扩增子的PCR效率是恒定的。而现有文献、实验表明，在很多情况下，这一假设难以达到。同时，在确定样本的Ct值方面，现有方法一般简单将3-15个循环的荧光信号标准偏差10倍对应的阈值作为Ct值确定依据、或者利用sigmoid、Richards等曲线模型，基于LM方法(Levenberg-Marquardt方法)、Akima插值法等纯数学方法进行拟合，得到拟合参数。阈值法只是一种经验做法，而Richards曲线模型拟合等数学方法虽然能得到较好的拟合效果，但计算复杂、无形中也与PCR指数扩增特性脱离了联系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种荧光定量的指标确定方法，以缓解了现有技术中存在的计算复杂的技术问题。第一方面，本专利技术实施例提供一种荧光定量的指标确定方法，包括：采集第一数量个循环对应的初始荧光定量PCR扩增数据；对第一数量中前第二数量个循环对应的初始PCR扩增数据进行线性拟合，确定扩增曲线基线；对初始PCR扩增数据去基线，得到目标PCR扩增数据；基于第一数量中除前第二数量以外的后第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据确定PCR的指标。在可选的实施方式中，基于第一数量中除前第二数量以外的后第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据确定PCR的指标的步骤包括：针对第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据，基于自适用多项式拟合方式确定目标指数区域；根据目标指数区域确定PCR的指标。在可选的实施方式中，针对第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据，基于自适用多项式拟合方式确定目标指数区域的步骤包括：确定第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据中荧光强度连续递增的第四数量个循环；针对第四数量个循环对应的目标PCR扩增数据取对数；运用自适用多项式拟合方式，找到目标窗口对应的目标指数区域。在可选的实施方式中，自适用多项式拟合方式包括自适用Savitzky-Golay线性拟合方式。在可选的实施方式中，运用自适用多项式拟合方式，找到目标窗口对应的目标指数区域的步骤，包括：根据Savitzky-Golay拟合原理及循环总数，确定窗口大小选择范围；在选择范围中依次确定当前窗口大小，针对每个当前窗口大小，在当前窗口大小对应的每一个滑动平移位置，计算决定系数；以及取当前窗口大小中最大的决定系数其对应初始窗口为当前窗口大小对应的最优指数区域；在初始窗口中选择最优的目标指数区域。在可选的实施方式中，PCR的指标包括Ct值、初始拷贝数目以及扩增效率；根据目标指数区域确定PCR的指标的步骤包括：根据目标指数区域确定Ct值；根据目标指数区域确定初始拷贝数目；根据目标指数区域确定扩增效率。在可选的实施方式中，第一数量个循环为所有循环。本专利技术提供的一种荧光定量的指标确定方法。通过采集第一数量个循环对应的初始荧光定量PCR扩增数据；对第一数量中前第二数量个循环对应的初始PCR扩增数据进行线性拟合，确定扩增曲线基线；对初始PCR扩增数据去基线，得到目标PCR扩增数据；基于第一数量中除前第二数量以外的后第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据确定PCR的指标。在原始荧光强度的基础上消除基线，从而去除其影响，计算简便，容易实现且精度高。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本申请实施例提供的一种荧光定量的指标确定方法流程示意图；图2为本申请实施例提供的一种荧光定量的指标确定方法的一个示例。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本专利技术实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本专利技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本专利技术的范围，而是仅仅表示本专利技术的选定实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。为此，我们回到基本的PCR指数扩增曲线。对于单个扩增样本，如果获得了其各个循环对应的荧光强度值，再通过合适的拟合方法，我们是可能获得其对应的指数扩增曲线参数的。这里，主要的难点在于，其一：如何消除基线即荧光本底强度的影响；其二：如何针对不同样本，自适应的选择合适的拟合参数，以便得到最优的指数拟合区。本专利技术针对这两个问题进行了研究：对于第一个问题，参考PCR扩增基本理论，基线值主要来源于扩增前期数个循环测量的偶然误差，一般具有平坦或者斜率值较小的线性趋势。为此，可以对扩增前期3-15个循环荧光强度数据进行线性拟合，然后以拟合得到的线性参数进行插值，得到所有循环对应的荧光强度本底数据即基线数据，再在原始荧光强度的基础上消除基线，从而去除其影响。对于第二个问题，在消除了基线的情况下，根据PCR扩增理论，其具有指数形式，当取对数之后为线性模型。Savitzky-Golay拟合滤波器是一种用多项式实现滑动窗内最小二乘拟合的方法，相对于其他滤波方法而言，这种方法能够有效去除信号中的脉冲噪声和白噪声、保留相对极大值、极小值和宽度等分布特性，而这些特性对于扩增曲线而言是非常有必要的。在Savitzky-Golay拟合中，数据窗口大小和拟合阶数对算法的处理效果有很大影响，为了得到扩增曲线上最优的指数拟合区域，可以对荧光强度数据取对数进行Savitzky-Golay线性拟合，以决定系数R2作为评价指标，找到最优的数据窗口大小，其对应的拟合区域即为最优的指数拟合区域。在此基础上，根据PCR最优的指数扩增区域，最终在脱离标准曲线的情况下，确定了Ct值、初始拷贝数目及扩增效率等荧光定量PCR指标。总体而言，该方法易于理解，容易实现，精度较高。下面结合附图，对本专利技术的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。图1为本专利技术实施例提供的一种荧光定量的指标确定方法流程示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光定量的指标确定方法，其特征在于，包括：/n采集第一数量个循环对应的初始荧光定量PCR扩增数据；/n对所述第一数量中前第二数量个循环对应的初始PCR扩增数据进行线性拟合，确定扩增曲线基线；/n对所述初始PCR扩增数据去基线，得到目标PCR扩增数据；/n基于所述第一数量中除前第二数量以外的后第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据确定PCR的指标。/n

【技术特征摘要】
1.一种荧光定量的指标确定方法，其特征在于，包括：
采集第一数量个循环对应的初始荧光定量PCR扩增数据；
对所述第一数量中前第二数量个循环对应的初始PCR扩增数据进行线性拟合，确定扩增曲线基线；
对所述初始PCR扩增数据去基线，得到目标PCR扩增数据；
基于所述第一数量中除前第二数量以外的后第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据确定PCR的指标。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于所述第一数量中除前第二数量以外的后第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据确定PCR的指标的步骤包括：
针对所述第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据，基于自适用多项式拟合方式确定目标指数区域；
根据所述目标指数区域确定所述PCR的指标。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，针对所述第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据，基于自适用多项式拟合方式确定目标指数区域的步骤包括：
确定所述第三数量个循环对应的目标PCR扩增数据中荧光强度连续递增的第四数量个循环；
针对所述第四数量个循环对应的目标PCR扩增数据取对数；
运用自适用多项式拟合方式，找到...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冬，杨智，贺贤汉，
申请(专利权)人：杭州博日科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33