一种特定基因区域DNA甲基化和去甲基化同步分析新方法技术

一种特定基因区域DNA甲基化和去甲基化同步分析新方法，可实现特定基因区域5‑甲基胞嘧啶和5‑羟甲基胞嘧啶的同步检测，其特征在于：所述新方法包括捕获、水解、分离、标记和测定五个步骤；其中所述捕获是用DNA限制性内切酶和特异性捕获探针钓取目标DNA片段；其中所述水解是用DNA外切酶将目标DNA片段水解为单核苷酸；其中所述分离是应用功能化纳米颗粒和磁分离技术对单核苷酸进行分离；其中所述标记是应用不同DNA探针标记的5‑甲基胞嘧啶单克隆抗体和5‑羟甲基胞嘧啶单克隆抗体识别目标分子；其中所述测定是在数字化PCR设备上完成两种不同标记DNA探针的定量分析。本发明专利技术可广泛用于科研和临床的检测，具有广阔的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
一种特定基因区域DNA甲基化和去甲基化同步分析新方法
本专利技术涉及一种分析方法，具体说是涉及特定基因区域DNA甲基化和去甲基化同步分析的方法。
技术介绍
DNA甲基化是在甲基转移酶作用下将甲基引入DNA链的生物过程，它不仅在基因表达调控中起着关键作用，而且在染色体重组和发育调节等生命活动中扮演重要角色。在人类成熟体细胞中，DNA甲基化几乎只发生于CpG二核苷酸中胞嘧啶的C5上，生成5-甲基胞嘧啶。另一方面，DNA甲基化是一种可逆的修饰，5-甲基胞嘧啶可在细胞不同阶段被TET酶作用氧化为5-羟甲基胞嘧啶，并通过随后的一系列酶促作用机制实现主动去甲基化。研究表明，5-羟甲基胞嘧啶可能具有解除5-甲基胞嘧啶抑制基因表达的效应。可见，5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶是DNA甲基化和去甲基化过程中的关键分子，它们在基因启动子区域、第一外显子、5’非编码区和3’非编码区等特定基因区域的变化与癌症、心血管疾病、代谢性疾病及炎症的发生发展密切相关。目前，用于特定基因区域5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法主要基于PCR扩增或DNA测序技术，其中重亚硫酸盐DNA测序则是特定基因区域甲基化分析的金标准。其原理是在PCR扩增之前须对DNA样本进行重亚硫酸盐处理，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶则被保留下来，进而通过PCR分析或DNA测序获得甲基化水平。但是，重亚硫酸盐处理不能区分5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶，基于此处理技术的分析结果是二者的总和，不能反映出5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶各自的浓度水平。另一方面，高效液相色谱和质谱联用等技术虽然可以对5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶进行同步测定，但其检出限无法满足特定基因区域痕量5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析要求。因此，亟需一种灵敏度更高的分析技术实现5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的同步快速分析。本专利技术基于5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的结构特点，设计特异性功能化纳米颗粒，通过磁分离技术实现5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分离；通过抗原抗体特异性结合对5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶进行不同DNA探针标记，最终借助数字PCR的单分子检测能力完成两种不同DNA探针的定量分析、从而实现痕量5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的同步检测，从根本上解决了传统分析方法不能同时测定特定基因区域痕量5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的正是基于5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的结构特点和数字PCR的单分子检测能力开发一种特定基因区域DNA甲基化和去甲基化的同步分析新方法。本专利技术的目的可通过下述技术措施来实现：本专利技术是一种特定基因区域DNA甲基化和去甲基化同步分析新方法，可实现特定基因区域5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的同步检测，所述新方法包括捕获、水解、分离、标记和测定五个步骤；其中所述捕获是根据特定基因区域的DNA序列，设计特异性捕获探针，从基因组DNA的限制性内切酶作用产物中钓取目标DNA片段；其中所述水解是用DNA外切酶将目标DNA片段水解为单核苷酸；其中所述分离是应用表面经过生物素和磷酸修饰的纳米金颗粒和磁分离技术对单核苷酸进行分离；其中所述标记是应用不同DNA探针标记的5-甲基胞嘧啶单克隆抗体和5-羟甲基胞嘧啶单克隆抗体识别目标分子；其中所述测定是在数字化PCR设备上完成两种不同标记DNA探针的定量分析，从而实现特定基因区域DNA甲基化和去甲基化的同步测定。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术是一种特定基因区域DNA甲基化和去甲基化同步分析新方法，基于5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的结构特点，设计特异性功能化纳米颗粒，通过磁分离技术实现5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分离；通过抗原抗体特异性结合对5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶进行不同DNA探针标记，最终借助数字PCR的单分子检测能力完成两种不同DNA探针的定量分析、从而实现痕量5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的同步检测，从根本上解决了传统分析方法不能同时测定特定基因区域痕量5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的问题。不但可以避免传统方法复杂的样品前处理，还能实现特定基因区域DNA甲基化和去甲基化的同步分析，可广泛应用到科研和临床实验室，具有广阔的市场前景。具体实施方式本专利技术以下将结合实施例作进一步描述，但并不限制本专利技术。实施例1本实施例的CYP24A1基因启动子区域DNA甲基化和去甲基化同步分析新方法，由捕获、水解、分离、标记和测定五个步骤组成，其具体步骤如下：(1)捕获：使用外周血基因组DNA提取试剂盒从1mL静脉血中获得基因组DNA样品，用Bfml酶对基因组DNA进行切割，应用序列为Biotin-AGATTCTCTGGAAAGGGGGTCTCAAG的特异性捕获探针和磁分离技术获得CYP24A1基因启动子区域的目标DNA片段；(2)水解：用核酸外切酶Ⅰ将获得的CYP24A1基因启动子区域目标DNA片段水解为单核苷酸；(3)分离：应用直径10纳米表面经过生物素和磷酸修饰的纳米金颗粒和直径200纳米表面经过链霉亲和素修饰的磁颗粒在磁场作用下对单核苷酸进行分离；(4)标记：使用序列分别为AGCCAATCCACTCAACACACGTTGTTGGAGCCTGTTTCGTACAGGAGCAACAGTCATCACCA和AGCCAATCCACTCAACACACTGGGTCTATTGATGTGGGGTACAGGAGCAACAGTCATCACCA的DNA探针标记5-甲基胞嘧啶单克隆抗体和5-羟甲基胞嘧啶单克隆抗体，用于识别5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶，并将过量的标记抗体洗涤丢弃；(5)测定：在数字化PCR设备上完成两种不同标记DNA探针的定量分析，从而获得CYP24A1基因启动子区域DNA甲基化和去甲基化水平。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特定基因区域DNA甲基化和去甲基化同步分析新方法，可实现特定基因区域5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的同步检测，其特征在于：所述新方法包括捕获、水解、分离、标记和测定五个步骤；其中所述捕获是根据特定基因区域的DNA序列，设计特异性捕获探针，从基因组DNA的限制性内切酶作用产物中钓取目标DNA片段；其中所述水解是用DNA外切酶将目标DNA片段水解为单核苷酸；其中所述分离是应用功能化纳米颗粒和磁分离技术对单核苷酸进行分离；其中所述标记是应用不同DNA探针标记的5-甲基胞嘧啶单克隆抗体和5-羟甲基胞嘧啶单克隆抗体识别目标分子；其中所述测定是在数字化PCR设备上完成两种不同标记DNA探针的定量分析；其中所述功能化纳米颗粒是表面经过生物素和磷酸修饰的直径小于100纳米的金颗粒；其中所述磁分离技术是应用表面经过链霉亲和素修饰的磁颗粒在磁场作用下实现分离。/n

【技术特征摘要】
1.一种特定基因区域DNA甲基化和去甲基化同步分析新方法，可实现特定基因区域5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的同步检测，其特征在于：所述新方法包括捕获、水解、分离、标记和测定五个步骤；其中所述捕获是根据特定基因区域的DNA序列，设计特异性捕获探针，从基因组DNA的限制性内切酶作用产物中钓取目标DNA片段；其中所述水解是用DNA外切酶将目标DNA片段水解为单核苷酸；其中所述分离是...

【专利技术属性】
技术研发人员：玉崧成，吴拥军，合思甜，何磊良，刘利娥，冯寅花，于斐，吴予明，刘洁，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41