本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种从基因水平检测Apo A分子KIV‑2亚型结构域的重复数检测的试剂盒及其检测方法。本发明专利技术的试剂盒采用基因合成的方法合成KIV‑2已知重复数的标准品，解决了无阳性样本或者样本样本量有限的确定；采用SYBR Green qPCR检测方法，能够高灵敏和特异性的检测总量≥1ng的基因组DNA，在1‑2内天快速得到结果。
【技术实现步骤摘要】
脂蛋白A亚型KIV-2结构域的拷贝数量检测试剂盒
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种从基因水平检测ApoA分子KIV-2亚型结构域的重复数检测的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
脂蛋白a(Lp(a))一种特殊的脂蛋白颗粒，血清Lp(a)浓度主要由基因控制，可作为动脉硬化性心脑血管疾病的独立危险因素指标。其结构在蛋白质方面与LDL很相似，但带有一个富含糖类和高度亲水性的载脂蛋白Apo(a)蛋白。Apo(a)蛋白中kringle4-2型结构域重复序列的数量由基因决定，每个Apo(a)粒子的KIV-2型重复数型重复数从3到40不等，因此Apo(a)的大小不仅在个体间且在同一个体都是高度可变的。研究kringle4-2型重复数、Lp(a)浓度与疾病相关性。现有方法主要通过实时荧光定量PCR检测，检测已知KIV-2型重复数样本与待测样本KIV-2型重复数，计算出待测样本KIV-2型重复数。此方法需要有已知KIV-2型重复数的情况下才能检测，所以没有阳性样本则无法开展相关实验，并且阳性样本量无法实现量产。因此，提供一种从基因水平检测ApoA分子KIV-2亚型结构域的重复数检测的试剂盒及其检测方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种检测KIV-2结构域的重复数量的诊断试剂盒及其制备方法、检测方法。通过基因合成标准品，解决了标准品差异较大，提高了检测方法的准确度等；通过qPCR及设计特异性引物提高了检测的灵敏度及特异性问题。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了引物组合，其特征在于，包括组合一和组合二：组合一：(1)、上游引物具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；和(2)、下游引物具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或(3)、如(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(4)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；组合二：(5)、上游引物具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；和(6)、下游引物具有如SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；或(7)、如(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(8)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个。本专利技术还提供了所述的引物组合在制备检测KIV-2结构域的重复数量的试剂和/或试剂盒中的应用。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了所述的引物组合在制备检测动脉硬化性心脑血管疾病的试剂和/或试剂盒中的应用。本专利技术还提供了检测KIV-2结构域的重复数量或检测动脉硬化性心脑血管疾病的试剂，包括所述的引物组合。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了检测KIV-2结构域的重复数量或检测动脉硬化性心脑血管疾病的试剂盒，包括所述的引物组合以及常用的助剂或载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品的序列具有：(1)具有如SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；或(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(3)、与(1)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了KIV-2结构域的重复数量的检测方法，取待测样本与所述的引物组合、所述的试剂或所述的试剂盒中的引物组合混合后扩增，检测。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了动脉硬化性心脑血管疾病的检测方法，取待测样本与所述的引物组合、所述的试剂或所述的试剂盒中的引物组合混合后扩增，检测。本专利技术的试剂盒采用基因合成的方法合成KIV-2已知重复数的标准品，解决了无阳性样本或者样本样本量有限的确定；采用SYBRGreenqPCR检测方法，能够高灵敏和特异性的检测总量≥1ng的基因组DNA，在1-2内天快速得到结果。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示专利中KIV和ALB引物溶解曲线结果图示，采用SYBRGreenqPCR检测方法，验证引物的特异性及重复性；图2示专利中KIV和ALB引物溶解曲线结果图示，采用SYBRGreenqPCR检测方法，验证引物的特异性及两对引物Ct值的差异。具体实施方式本专利技术公开了一种检测KIV-2结构域的重复数量的诊断试剂盒及其检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的检测KIV-2结构域的重复数量的诊断试剂盒及其检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例11、标准品的合成：在上海百力格生物订购，合成下列序列，作为标准品原液DNA序列(如SEQIDNo.5所示)。GGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTAAGTAGATAAGAAATTATTCTTTTATAGCTTTGGCATGACCTCACAACTTAGGAGGATAGCCTAGGCTTTTCTGTGGAGTTGCTAAAGTTGAGTTCGGAGAACTCAGCTTGAAGCATGTCTCTTGTCACAGAAACTTCAGTTGGCCCTTTATTCTCTTATGGTAAAGAACAAAGACATACGCATTTGGGTAGTATTCTGGGGTCCGACTATGCGAGTGTGGTGTCATAGATGACCAAGCTTGGCAGGTTCTTCCAGTGACAGTGGTGGAGTATGTGCCTCGATAACTCTGTCCATTACCGTGGTAGCACTCCTGCACCCCAGGCCTCTGCTCAGTCGG本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.引物组合，其特征在于，包括组合一和组合二：/n组合一：/n(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和/n(2)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或/n(3)、如(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或/n(4)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；/n组合二：/n(5)、上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和/n(6)、下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或/n(7)、如(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或/n(8)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。/n
【技术特征摘要】
1.引物组合，其特征在于，包括组合一和组合二：
组合一：
(1)、上游引物具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；和
(2)、下游引物具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或
(3)、如(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
组合二：
(5)、上游引物具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；和
(6)、下游引物具有如SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；或
(7)、如(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(8)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个。
3.如权利要求1或2所述的引物组合在制备检...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈林，李文涛，高鹏飞，杨敬敏，何方，郭志晨，张贝，
申请(专利权)人：上海韦翰斯生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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