一种真基因变异的检测方法技术

本发明专利技术涉及遗传病基因检测领域，特别是涉及一种真基因变异的检测方法，所述方法包括如下步骤：设计仅能与目的核酸区域的假基因序列结合的酶切探针，利用酶切探针和限制性核酸内切酶酶切目的核酸区域的假基因，回收酶切后产物；扩增回收的产物即为真基因序列，构建测序文库并测序，数据分析得到真基因的变异位点。本发明专利技术的检测方法通过酶切探针和内切酶的作用，将干扰序列进行切除，减少或完全消除假基因的干扰，保留所需的DNA序列，提高检测结果的可信度。可信度。

【技术实现步骤摘要】
一种真基因变异的检测方法


[0001]本专利技术涉及遗传病基因检测领域，特别是涉及一种真基因变异的检测方法。

技术介绍

[0002]自人类基因组计划完成以来，科学家相继完成了多个给生物基因组的测序工作，庞大的数据让科学家对基因组有了全面的认识。研究表明，人类的基因组大约有30多亿个碱基对，而其中仅有不到2％的DNA序列编码蛋白质，其余98％以上的序列不参与蛋白表达，而假基因就是其中之一。
[0003]假基因是指具有与功能基因相似的序列，目前研究表明，假基因主要通过两种途径产生：1、细胞在分裂之前复制整个基因组时，DNA复制或染色体交换过程中功能基因的编码区或调控区发生的各种突变(碱基的插入、确实、置换或移码)，均会导致复制后的基因无法编码，从而丧失正常功能而成为假基因，这种假基因称为重复假基因；2、DNA转录为mRNA后再逆转录为cDNA并重新整合进入基因组，在此过程中因为插入位点不合适或序列发生突变而失去正常功能，这种假基因称为加工假基因或返座假基因。
[0004]由于假基因与真基因存在高度的序列相似性，所以正确区分假基因和真基因就成为检测真基因变异的关键环节。在人类基因组中已发现的假基因多达8000个，在相对应的真基因检测中其可以干扰真基因的检测结果，从而增加假阳性和假阴性的概率。
[0005]目前已有的检测真基因的有手段主要为长片段扩增，通过特异性引物将真基因扩增，进而测序检测，但是当真假基因同源性高、片段长时，现有的方法无法进行真基因的全基因扩增和测序，且扩增稳定性差、假基因占比高。<br/>[0006]现有的二代测序方法由于测序读长较短，无法甄别序列同源性高的真假基因，数据中存在假基因序列干扰，会导致将假基因上的变异或假基因特异位点误认为真基因变异位点，或真基因变异位点如果和假基因特异位点一致，则无法判断该位点来自于真基因还是假基因，从而导致检测假阴性和假阳性的发生。

技术实现思路

[0007]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种真基因变异的检测方法，用于解决现有技术中的问题。
[0008]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种真基因变异的检测方法，所述方法包括如下步骤：
[0009]1)设计仅能与目的核酸区域的假基因序列结合的酶切探针，利用酶切探针和限制性核酸内切酶酶切目的核酸区域的假基因，回收酶切后产物；
[0010]2)扩增步骤1)回收的产物即为真基因序列，构建测序文库并测序，数据分析得到真基因的变异位点。
[0011]如上所述，本专利技术的真基因变异的检测方法，具有以下有益效果：通过酶切探针和内切酶的作用，将干扰序列进行切除，减少或完全消除假基因的干扰，保留所需的DNA序列，
提高检测结果的可信度。
附图说明
[0012]图1显示为PKD1基因第15号外显子内的一段区域。
[0013]图2显示为对PKD1基因的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳结果图。
[0014]图3显示为酶切后电泳谱图，从左到右图谱分别为DL50 Marker、实验组、对照组一、对照组二、DL50 Marker。
[0015]图4显示为对照组一代测序结果。
[0016]图5显示为实验组一代测序结果。
[0017]图6
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1为依据真基因的序列设计酶切探针的示意图，图6
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2为依据假基因的序列设计酶切探针的示意图。
具体实施方式
[0018]本专利技术提供一种真基因变异的检测方法，所述方法包括如下步骤：
[0019]1)设计仅能与目的核酸区域的假基因序列结合的酶切探针，利用酶切探针和限制性核酸内切酶酶切目的核酸区域的假基因，回收酶切后产物；
[0020]2)扩增步骤1)回收的产物，得到的扩增产物即为真基因，构建测序文库并测序，数据分析得到真基因的变异位点。
[0021]所述目的核酸区域为真假基因差异性位点所在的区域。在一种实施方式中，所述目的核酸区域的长度为200bp～20kb。目的核酸区域为通过PCR扩增得到的扩增产物。
[0022]在一种实施方式中，步骤1)中酶切的目的核酸区域为经过富集的目的核酸区域，或称预扩增产物。所述富集目的核酸区域的方法即从核酸的初始集合中选择性PCR扩增目标核酸区域。PCR扩增是指通过设计特异性位点的引物进行扩增。
[0023]一般的，所述特异性位点引物只要能够在PCR实施条件下特异性地识别各自的特异性识别区域(优选在单一的反应容器内使用的引物之间不发生退火及自退火)即可。对于各引物的长度而言，只要能够特异性地识别对应的特异性识别区域、且引物之间不发生杂交即可，没有特别限制。
[0024]较佳的，所述特异性位点引物的设计方法如下：在真假基因差异性位点上下游各100bp～10kb的区间内，在真基因的特异性序列上分别选取15bp～30bp作为上、下游引物序列，引物序列的GC含量为40％～70％，3
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末端无连续的G或C。
[0025]在一种实施方式中，将扩增产物进行电泳、纯化后，再进行步骤1)的酶切。
[0026]所述酶切探针具有如下特征中的一个或几个：
[0027]A、酶切探针5
’
端或者两端磷酸化；
[0028]B、酶切探针长度为10nt～30nt；
[0029]C、酶切探针5
’
端第一个碱基为T；
[0030]D、酶切探针上5
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端的T为1号位置，真假基因差异位点对应探针的9～12号位置；优选为10～11号位置。
[0031]所述探针的长度选自以下范围中的一种或几种：10～13nt、13～16nt、16～20nt、20～25nt、25～30nt。优选的，选自13nt～20nt。更优选的，为15～17nt。
[0032]在一种实施方式中，酶切探针5
’
端第一个碱基的T可额外加入。即在假基因的特异性序列上选取15bp～30bp作为探针序列后，若第一个碱基不是T，可在5
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端第一个碱基的位置另外加入T。加入T之后的酶切探针的序列与被酶切的序列差异小于3nt；优选的，序列差异在0～1nt。除差异序列外，酶切探针与被酶切的序列反向互补。
[0033]所述酶切探针是根据目的核酸区域真假基因的DNA序列的差异设计的，且仅能与目的核酸区域的假基因序列结合。
[0034]在一种实施方式中，酶切探针设计方法如图6所示，在真假基因DNA序列的差异处，选取假基因序列上13bp～20bp，选取后的序列若第一个碱基是T，则可以直接作为探针序列；若第一个碱基不是T，再在5
’
端第一个碱基的位置加入T后即可作为探针序列。当然，也可以先选取真基因序列上15bp～30bp，再将选中的序列中真基因与假基因不同的碱基替换为假基因的碱基，选取后的序列若第一个碱基是T，则可以直接作为探针序列；若第一个碱基不是T，再在5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种真基因变异的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)设计仅能与目的核酸区域的假基因序列结合的酶切探针，利用酶切探针和限制性核酸内切酶酶切目的核酸区域的假基因，回收酶切后产物；2)扩增步骤1)回收的产物，得到的扩增产物即为真基因，构建测序文库并测序，数据分析得到真基因的变异位点。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶切探针根据目的核酸区域真假基因DNA序列的差异设计。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶切探针具有如下特征中的一个或几个：A、酶切探针5
’
端或两端磷酸化；B、酶切探针长度为10nt～30nt；C、酶切探针5
’
端第一个碱基为T；D、酶切探针上5
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端的T为1号位置，真假基因差异位点对应探针的9～12号位置；优选的，为10～11号位置。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶切探针的长度为13nt～20nt；优选的，为15～17nt。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶切探针的序列与被酶切的序列差异小于3nt；优选的，序列差异为0～1nt；除...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃振东，林健，朱学萍，唐嘉婕，杨敬敏，高鹏飞，
申请(专利权)人：上海韦翰斯生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：