用于鲍曼不动杆菌检测的引物、探针及其检测方法技术

本发明专利技术提供了用于鲍曼不动杆菌检测的引物、探针、试剂盒，其中探针的序列如SEQ ID NO.:11所示，或者在序列SEQ ID NO.:11的两端有基团修饰。应用本发明专利技术的用于鲍曼不动杆菌检测的引物对和探针，对目标菌株的DNA进行实时荧光PCR检测时，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。

【技术实现步骤摘要】
用于鲍曼不动杆菌检测的引物、探针及其检测方法
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及用于鲍曼不动杆菌检测的引物、探针及其检测方法。
技术介绍
鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌。该菌是医院感染的重要病原菌，主要引起呼吸道感染，也可引发菌血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染、呼吸机相关性肺炎等。对常用抗生素的耐药率有逐年增加的趋势，并引起临床医生和微生物学者的严重关注。因此，为了有效地检测鲍曼不动杆菌，本领域迫切需要开发特异性好、灵敏度高、简单便捷的鲍曼不动杆菌检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的首先在于提供一种用于鲍曼不动杆菌检测的引物，该引物选自如：SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示的引物对；或SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示的引物对；或SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6所示的引物对；或SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8所示的引物对；或SEQIDNO.:9和SEQIDNO.:10所示的引物对。其中，优选的引物选自如：SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示的引物对；或SEQIDNO.:9和SEQIDNO.:10所示的引物对。进一步优选的引物选自如SEQIDNO.:9和SEQIDNO.:10所示的引物对。具体的上述引物的序列见如下表1：表1引物和探针序列本专利技术还提供了一种用于鲍曼不动杆菌检测的探针，该探针的序列如SEQIDNO.:11所示；该探针的5’端和3’端还有基团修饰，用于荧光定量PCR检测；具体的说，本专利技术的一种用于鲍曼不动杆菌检测的探针，其5’端由FAM修饰，3’端由MGB修饰，具体序列如下：5’FAM-gaaggcggggacgacgtcaa-3’MGB其中，FAM为荧光基团，MGB为淬灭基团；本专利技术还提供了一种用于鲍曼不动杆菌检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述用于鲍曼不动杆菌检测的引物(如表1所示)；和/或上述用于鲍曼不动杆菌检测的探针；具体的探针为：5’FAM-gaaggcggggacgacgtcaa-3’MGB；进一步的，所述试剂盒中还有标准品对照；进一步的，所述试剂盒还包括：Taq酶、dNTP、和/或Mg2+。本专利技术还提供了一种用于鲍曼不动杆菌检测的方法，该方法包括如下步骤：(1)提取待检样本的DNA；(2)使用上述用于鲍曼不动杆菌检测的引物和探针，进行荧光定量PCR检测。本专利技术的引物在检测鲍曼不动杆菌DNA时能够同时具备高灵敏度和高特异性，从而能准确而灵敏地检测产品，例如环境样品、食品、保健品、化妆品中的鲍曼不动杆菌的含量，或者血液样本、组织样本中是否含有鲍曼不动杆菌，从而用于感染性疾病的诊断。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。虽然在本专利技术的实施或测试中可以使用与本专利技术中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本文所用的术语“探针”具有本领域技术人员常规理解的意义，即，一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。探针可以处于液相中，也可以固定于固相上。本专利技术中，鲍曼不动杆菌16srRNA引物探针设计的靶序列如SEQIDNO.12所示。本专利技术的主要优点在于：本专利技术提供的用于鲍曼不动杆菌检测的引物和探针，对目标菌株的DNA进行实时荧光PCR检测时，不仅能检测是否感染鲍曼不动杆菌的定性检测，还能进行鲍曼不动杆菌的定量检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。在具体的实施例中，检测的灵敏度可以达到1fg/μL。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。附图说明图1：使用各引物对针对鲍曼不动杆菌特异性检测；图2：使用引物对5针对鲍曼不动杆菌标准品的灵敏度检测结果。(其中五条曲线从左到右，稀释度分别为1/10、1/100、1/1000、1/10000、1/100000)图3：临床样本中鲍曼不动杆菌的敏感性检测具体实施方式下面结合具体实施例，进一步详陈本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。材料和方法1.样本处理试剂：(柱纯化回收)包括蛋白酶K20mg/ml，溶菌酶(革兰氏阳性菌需添加)，预处理缓冲液，结合缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱缓冲液，结合柱，收集管，1.5ml离心管。2.DNA检测体系：2xTaqmanmix：含有Taq酶、dNTP、Mg2+、本专利技术引物及探针等成分。掺加标准品，阴性质控，DNA稀释液3.检测仪器：Roche480Ⅱ。4.实验操作及过程4.1根据说明书进行基因组DNA提取纯化操作(试剂盒：广州美基生物MD5131-01)：1)在1.5ml离心管中加入20μlProteinaseK(具体体积根据样本多少可调整)。2)加入样本，加入200μl缓冲液GB，抽打混匀或振荡混匀。3)将离心管置于56℃，直至组织完全消化。4)每孔加入200μl无水乙醇，抽打混匀或振荡混匀，室温放置5分钟。5)每孔加入15μl磁珠悬浮液B，抽打混匀或振荡混匀。6)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体。7)将离心管从磁力架上取下，加入500μl缓冲液GD，抽打混匀或振荡混匀。8)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体。9)将离心管从磁力架上取下，加入600μl漂洗液PW，抽打混匀或振荡混匀。10)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体；11)重复操作步骤9、10，液体尽量去除干净。12)离心管于磁力架上，室温晾干10-15分钟。13)将离心管从磁力架上取下，加入50-100μl洗脱液TB，抽打混匀振荡混匀，置于56℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鲍曼不动杆菌检测的引物，其特征在于该引物选自如：/nSEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示的引物对；/n或SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示的引物对；/n或SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物对；/n或SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物对；/n或SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物对。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于鲍曼不动杆菌检测的引物，其特征在于该引物选自如：
SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示的引物对；
或SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示的引物对；
或SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6所示的引物对；
或SEQIDNO.:7和SEQIDNO.:8所示的引物对；
或SEQIDNO.:9和SEQIDNO.:10所示的引物对。


2.根据权利要求1所述的用于鲍曼不动杆菌检测的引物，其特征在于该引物选自如：
SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示的引物对；
或SEQIDNO.:9和SEQIDNO.:10所示的引物对。


3.根据权利要求1所述的用于鲍曼不动杆菌检测的引物，其特征在于该引物为SEQIDNO.:9和SEQIDNO.:10所示的引物对。


4.一种用于鲍曼不动杆菌检测的探针，其特征在于该探针的序列如SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋元林，周建，陈翠翠，王葆青，李华茵，郭玮，王蓓丽，杨轶慧，宋振云，于秀艳，曾宪航，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31