一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法技术

本发明专利技术公开了一种快检测BRAF‑KIAA1549融合突变的方法。本发明专利技术使用BRAF‑KIAA1549融合后RNA作为反应的起始模板，有效地避免了基因组DNA的干扰，使检测结果更加准确；反转录与实时PCR共用一个反应体系，较传统的反转录后再以cDNA为模板扩增后检测，步骤更为精简，且避免了多次开盖可能造成的污染；通过荧光基团的改变，在单一体系中引入了管家基因ACTB，保证了阴性对照的存在，降低了假阴性的风险；通过对ΔCt对结果进行判读，降低了假阳性的风险，使实验结果更为准确可信；所设计的PCR产物相对较小，使得降解程度较高的石蜡包埋样本亦可满足检测要求。本发明专利技术公开的检测方法操作精简，有效地规避了冗余的步骤和可能的污染，同时加入对照，保证了检测结果的可信度和准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法
本专利技术涉及癌症检测和分子生物学领域，尤其是一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法。
技术介绍
恶性肿瘤是目前严重影响人类健康的疾病之一，其内部成因是由于细胞内基因发生改变，致使细胞生长调控失常，导致异常增生，从而生成肿瘤。BRAF基因是Ras-Raf-MEK-ERK信号通路的重要转到因子，是人类癌症中最常见的突变基因之一。Ras-Raf-MEK-ERK信号通路是一条可被广泛激活的有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-ActivatedProteinKinase，MAPK)通路，通过有丝蛋白激酶通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶来参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的恶变等多种生物学反应。BRAF基因可与多种基因重排，在肿瘤发生发展中起着重要的作用，其中KIAA1549-BRAF融合突变可发生于60％-80％的毛细胞星形细胞瘤。在BRAF-KIAA1549融合突变中，BRAF的N端自身抑制结构域被KIAA1549替代，而BRAFC端结构域被保留，保留了激酶活性，导致MAPK通路被异常激活，从而导致肿瘤发生。对于BRAF-KIAA1549融合突变暂无蛋白质水平层面的有效检测方法，而常规BRAF断裂探针和BRAF-KIAA1549融合基因探针不能完全区分阳性和阴性样本。因此，本专利技术提出一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的上述问题，本专利技术提出一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法，包括以下步骤：(1)提取肿瘤组织的RNA；(2)构建PCR反应体系；(3)通过TaqMan探针法进行实时荧光定量PCR；(4)结果判读。上述的一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法，所述步骤(2)具体为：以步骤(1)提取的RNA为模板，将反转录酶、聚合酶、BRAF-KIAA1549上下游引物及BRAF-KIAA1549TaqMan探针、ACTB上下游引物及ACTBTaqMan探针加入到同一个反应体系中，通过改变PCR反应体系的反应温度，实现cDNA构建、PCR产物扩增和荧光信号收集三个过程。上述的一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法，所述步骤(4)具体为：通过ΔCt的数值大小来判定样本是否为BRAF-KIAA1549突变阳性，其中，ΔCt＝Ct(BRAF-KIAA1549)-Ct(ACTB)；0＜ΔCt＜10，则该样本为BRAF-KIAA1549突变阳性；ΔCt＝10，建议提高RNA用量，重新检测；ΔCt＞10或未收集到BRAF-KIAA1549特异性荧光新号，则该样本为BRAF-KIAA1549阴性。上述的一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法，所述BRAF-KIAA1549上游引物序列为5’AGTGGGGGTCCTTCTACAGC-3’，所述BRAF-KIAA1549下游引物序列为5’TCCTCCATCACCACGAAATCC-3’，所述BRAF-KIAA1549TaqMan探针序列为5’-FAM-CAGCCCAGACGGCCAA-BHQ1-3’；所述ACTB上游引物序列为5’CTTCGCGGGCGACGAT-3’，所述ACTB下游引物序列为5’ATAGGAATCCTTCTGACCCATGC-3’，所述ACTBTaqMan探针序列为5’-HEX-CGGGCCGTCTTCCC-BHQ1-3’。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术使用BRAF-KIAA1549融合后RNA作为反应的起始模板，有效地避免了基因组DNA的干扰，使检测结果更加准确；(2)本专利技术中反转录与实时PCR共用一个反应体系，完成以RNA为模板的cDNA构建、以cDNA为模板的PCR扩增，和Taqman探针对产物的检测。较传统的反转录后再以cDNA为模板扩增后检测，步骤更为精简。单一的体系构建，避免了多次开盖可能造成的污染；(3)本专利技术采用Taqman实时PCR来检测BRAF-KIAA1549融合突变情况，较琼脂糖凝胶电泳，避免了开盖可能造成的污染；较SYBRGreen实时PCR法，Taqman特异性探针更为灵敏、准确；(4)本专利技术中通过荧光基团的改变，在单一体系中引入了管家基因ACTB，保证了阴性对照的存在，降低了假阴性的风险；通过对ΔCt对结果进行判读，降低了假阳性的风险，使实验结果更为准确可信；(5)本专利技术所设计的PCR产物相对较小，使得降解程度较高的石蜡包埋样本亦可满足检测要求。综上所述，该检测方法操作精简，有效地规避了冗余的步骤和可能的污染，在保证检测简洁的同时，加入对照，保证了检测结果的可信度和准确性。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图1为实施例1中样本1TaqMan实时PCR扩增图谱；图2为实施例2中样本2TaqMan实时PCR扩增图谱。具体实施方式为使本领域技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作详细说明。【实施例1】一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法，包括以下步骤：(1)提取样本1肿瘤组织的RNA；(2)构建PCR反应体系；(3)通过TaqMan探针法进行实时荧光定量PCR；(4)结果判读。进一步的，对于样本1RNA的提取步骤如下：石蜡样本脱腊：取5张7μm样本1石蜡组织切片放入1.5ml离心管中，加入1ml二甲苯，13,000xg离心1分钟，弃上清后，再加入1ml二甲苯，13,000xg离心1分钟，弃上清。向离心管中加入1ml无水乙醇，13,000xg离心1分钟，弃上清后，晾干；向晾干的组织中加入组织裂解液和蛋白酶K，56℃裂解15分钟后，将离心管转移至80℃，保持15分钟后取下，待将至室温，向离心管内加入DNase，室温放置15分钟；向样本中加入结合缓冲液和无水乙醇，轻轻混匀后转移至RNA提取过滤柱，13,000xg离心1分钟后，向其中加入600μL清洗缓冲液，13,000xg离心1分钟，重复清洗三次；过滤柱放入新1.5ml离心管中，将离心管置于56℃，开盖晾干3分钟后，加入洗脱液，盖上盖子，56℃保持2分钟；13,000xg离心1分钟，获得样本1RNA样本。进一步的，PCR反应体系构建过程如下：首先取2μLRNA作为构建cDNA的模板，在反应体系中引入管家基因ACTB，保证了阴性对照的存在，降低了假阳性的风险，有利于结果判读，具体反应体系的组分如下：通过改变反应体系的反应温度，实现cDNA构建、PCR产物扩增和荧光信号收集三个过程，具体反应程序如下：反应体系构建完成后，进行TaqMan实时PCR检测BRAF-KIAA1549融合突变情况。进一步的，所述步骤(4)具体为：通本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)提取肿瘤组织的RNA；/n(2)构建PCR反应体系；/n(3)通过TaqMan探针法进行实时荧光定量PCR；/n(4)结果判读。/n

【技术特征摘要】
20200605 CN 202010506271X1.一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取肿瘤组织的RNA；
(2)构建PCR反应体系；
(3)通过TaqMan探针法进行实时荧光定量PCR；
(4)结果判读。


2.根据权利要求1所述的一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：以步骤(1)提取的RNA为模板，将反转录酶、聚合酶、BRAF-KIAA1549上下游引物及BRAF-KIAA1549TaqMan探针、ACTB上下游引物及ACTBTaqMan探针加入到同一个反应体系中；通过改变PCR反应体系的反应温度，实现cDNA构建、PCR产物扩增和荧光信号收集三个过程。


3.根据权利要求1所述的一种快检测BRAF-KIAA1549融合突变的方法，其特征在于，所述步骤(4)具体为：通过ΔCt的数值大小来判定样本是否为BRAF-KIAA1549...

【专利技术属性】
技术研发人员：相学平，陈柯冰，秦樾，童莹慧，
申请(专利权)人：杭州布平生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33