猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法技术

本发明专利技术公开了猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法，将猪繁殖与呼吸综合征病毒传代致弱株Gxnn1396‑P96作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域465个核苷酸并在缺失位置插入红色荧光蛋白基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入绿色荧光蛋白基因，获得插入双荧光蛋白基因标记的重组PRRSV病毒。测序表明重组病毒遗传稳定，在细胞内连续传至20代内未发现插入的标记基因的荧光丰富度降低。综上，本发明专利技术建立了一套猪繁殖与呼吸综合征活病毒载体系统，可同时插入多种外源基因，较一般的活病毒载体系统更加高效，且遗传稳定，为研制重组猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法
本专利技术属于猪繁殖与呼吸综合征病毒
，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)，又名“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的猪的一种高度接触性传染性疾病，以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸障碍为特征，猪是唯一的感染宿主，自1987年在美国首次发现PRRSV感染至今，PRRSV已经经历了多次爆发，给世界的养猪业带来了巨大的经济损失。PRRSV属套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的成员，基因组为单股正链RNA，全长约15.6kb，含有至少10个开放阅读框，5＇端含有帽子结构，3＇端含有PolyA。ORF1a和ORF1b约占据了基因组3/4，它们编码病毒复制酶蛋白pp1a和pp1b。pp1a和pp1b复制酶蛋白通过自剪切形成了14个非结构蛋白。ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7编码病毒的结构蛋白，其中ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4和ORF5a编码的病毒的次要结构蛋白GP2a、2b、GP3、GP4和GP5a，ORF5、ORF6和ORF7编码病毒的主要结构蛋白GP5、M和N。PRRSV反向遗传系统的快速发展为PRRSV作为活病毒载体疫苗的研发打下了坚实的基础。NSP2是PRRSV编码的所有蛋白中变异最大的,在NSP2高变区(HVR)经常发生氨基酸的缺失和插入.截止到目前为止，国内外多名学者都将NSP2的HVR区域作为外源基因插入的靶点，但是获得的重组病毒遗传不稳定，大多插入的外源基因在连续传代的过程中逐渐丢失。除此之外，还有另外一种策略是通过插入额外的独立转录单元来产生额外的亚基因组mRMA(sgmRNA)来表达外源基因。由于PRRSV大多数的开放阅读框之间都存在交叉重叠，故这种策略所能选择的靶点有限。到目前为止，ORF1b和ORF2a、ORF7和3’UTR是人们研究较多的外源基因插入位点。该策略在外源基因后插入一个转录调控序列(TRS)，插入的外源基因的sgmRNA由外源基因上游基因组TRS调控合成，而人工插入的TRS调控下游病毒结构蛋白的sgmRNA的产生，利用这种策略，国内外学者拯救出多种重组病毒，且部分重组病毒在连续传代的过程中保持稳定。目前为止，以PRRSV表达外源基因的研究主要为单一位点且部分重组病毒遗传不稳定，暂没有多个位点同时稳定表达外源基因的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株的构建方法，将猪繁殖与呼吸综合征病毒Gxnn1396-P96作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域465个核苷酸(3049-3513nt)并在缺失位置插入一标记基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入另一标记基因，获得插入双基因标记的重组PRRSV病毒。猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法，将猪繁殖与呼吸综合征病毒传代致弱株Gxnn1396-P96作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域465个核苷酸(3049-3513nt)并在缺失位置插入红色荧光蛋白基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入绿色荧光蛋白基因，获得插入双荧光蛋白基因标记的重组PRRSV病毒。所述重组PRRSV病毒为rGX-RFP-GFP。上述构建方法，包括以下步骤：(1)表达红色荧光蛋白的PRRSVNSP2缺失突变体pGX-NSP2-RFP的构建在PRRSV感染性克隆中，采用SOE-PCR方法缺失NSP2高变区第624位氨基酸-778位氨基酸位点区域，同时在缺失的区域引入了BstZ17I和SbfI两个酶切位点，先构建NSP2155aa缺失突变体pGX-NSP2-D465，然后，插入红色荧光蛋白(RFP)基因，获得在NSP2的插入RFP重组克隆pGX-NSP2-RFP。(2)在PRRSVORF1b和ORF2a间表达绿色荧光重组克隆pGX-12BS-GFP的构建在PRRSV感染性克隆中，利用SOE-PCR方法在ORF1b和ORF2a间引入BstbI和SbfI两个限制性酶切位点，并将SOE-PCR产物克隆到ZeroPCR载体上，获得pTOPO-12BS；利用突变PCR将将转录调控序列TRS(序列表SEQ.NO.ID.16)克隆到SbfI酶切位点之后，获得pTOPO-12BS-TRS，通过AscI和MluI将含有酶切位点和TRS的相应片段克隆进入pGXAM，获得重组克隆pGX-12BS-TRS；在此基础上，使用人为引入的酶切位点BstbI和SbfI将GFP克隆进入pGX-12BS-TRS，获得重组质粒pGX-12BS-GFP。(3)同时表达红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组质粒pGX-RFP-GFP的构建使用AscI和MluI两个限制性酶切位点同时酶切pGX-12BS-GFP和pGX-NSP2-RFP，回收酶切产物后使用T4酶进行连接，获得pGX-RFP-GFP。步骤(1)具体按以下进行操作：以PRRSV的全长感染性克隆pGXAM为模板，使用JX451F和JX6463R扩增，PCR产物克隆到ZeroPCR载体，获得穿梭质粒pTOPO-P2；以pTOPO-P2为模板，使用突变引物NSP2D155BstZ17IF和NSP2D155SbfIR以及外侧引物GX2350F和GX3921R扩增得到PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI；以PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI为模板，使用外侧引物GX2350F和GX3921R进行第二轮融合PCR扩增，将PCR产物GF-D155R-BstZ17IF和D155F-JR-SbfI进行融合，将融合PCR产物和pTOPO-P2同时使用AfeI和BbsI限制性酶切位点进行消化，T4连接后获得缺失155aa和引入Bstz17I和SbfI限制性酶切位点pTOPO-P2-D465，使用SpeⅠ和AflII同时酶切pTOPO-P2-D465和pGXAM，进行相应区域的等段替换，获得pGX-NSP2-D465；在此基础上，使用引物RFPBstZ17IF和RFPSbfIR扩增红色荧光蛋白基因，使用BstZ17I和SbfI酶切pGX-NSP2-D465，获得在NSP2缺失区域插入RFP基因的重组克隆pGX-NSP2-RFP。步骤(2)具体按以下进行操作：以PRRSV的全长感染性克隆pGXAM为模板，使用突变引物12BSF和12BSR以及外侧引物GF11706和JX14402MluI扩增出包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株的构建方法，其特征在于：将猪繁殖与呼吸综合征病毒Gxnn1396-P96作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域465个核苷酸并在缺失位置插入一标记基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入另一标记基因，获得插入双基因标记的重组PRRSV病毒。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株的构建方法，其特征在于：将猪繁殖与呼吸综合征病毒Gxnn1396-P96作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域465个核苷酸并在缺失位置插入一标记基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入另一标记基因，获得插入双基因标记的重组PRRSV病毒。


2.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法，其特征在于：将猪繁殖与呼吸综合征病毒传代致弱株Gxnn1396-P96Gxnn作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域465个核苷酸并在缺失位置插入红色荧光蛋白基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入绿色荧光蛋白基因，获得插入双荧光蛋白基因标记的重组PRRSV病毒。


3.根据权利要求2所述的的构建方法，其特征在于：所述重组PRRSV病毒为rGX-RFP-GFP。


4.根据权利要求2所述的的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)表达红色荧光蛋白的PRRSVNSP2缺失突变体pGX-NSP2-RFP的构建
在PRRSV感染性克隆中，采用SOE-PCR方法缺失NSP2高变区第624位氨基酸-778位氨基酸位点区域，同时在缺失区域引入了BstZ17I和SbfI两个酶切位点，先构建pGXAM的缺失突变体pGX-NSP2-D465，然后，插入红色荧光蛋白RFP基因，获得重组质粒pGX-NSP2-RFP。
(2)在PRRSVORF1b和ORF2a间表达绿色荧光重组克隆pGX-12BS-GFP的构建。
在PRRSV感染性克隆中，利用SOE-PCR方法在ORF1b和ORF2a间引入BstbI和SbfI两个限制性酶切位点，并将SOE-PCR产物克隆到ZeroPCR载体上，获得穿梭质粒pTOPO-12BS；利用突变PCR将转录调控序列TRS克隆到SbfI酶切位点之后，获得pTOPO-12BS-TRS，通过将AscI和MluI酶切pTOPO-12BS-TRS获得的相应片段克隆进入pGXAM，获得重组克隆pGX-12BS-TRS；在此基础上，通过人为引入的酶切位点BstbI和SbfI将GFP插入pGX-12BS-TRS中，获得重组质粒pGX-12BS-GFP。
(3)同时表达红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组质粒pGX-RFP-GFP的构建
使用AscI和MluI两个限制性酶切位点同时酶切pGX-12BS-GFP和pGX-NSP2-RFP，回收相应酶切产物后，通过T4酶进行连接，获得重组质粒pGX-RFP-GFP。


5.根据权利要求4所述的的构建方法，其特征在于步骤(1)具体按以下进行操作：以PRRSV的全长感染性克隆pGXAM为模板，使用JX451F和JX6463R扩增，PCR产物克隆到ZeroPCR载体，获得穿梭质粒pTOPO-P2；以pTOPO-P2为模板，使用突变引物NSP2D155BstZ17IF和NSP2D155SbfIR以及外侧引物GX2350F和GX3921R扩增得到PCR产物GF-D1...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦祖樟，王豪，谢欣，任同伟，王玉旭，贺微，陈樱，欧阳康，黄伟坚，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45