基于PCR的病毒快速检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供病毒保保液，核酸扩增反应制剂(可以为冻干粉末形式)，基于qPCR的通过核酸扩增检测病毒的方法和PCR试剂盒。该病毒保存溶液可以在室温下长时间保存病毒样品并防止RNA降解。样品溶液可直接与核酸扩增反应制剂混合用于qPCR扩增，而无需进行病毒核酸提取步骤，可快速，高灵敏度检测病毒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于PCR的病毒快速检测方法及其试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种病毒保存液、核酸扩增反应液、核酸PCR扩增方法、PCR扩增试剂盒。
技术介绍
目前，常用的病毒RNA检测方法通常包括三个步骤：1)采集受试者的病毒样本并将样本转移到实验室；2)通过硅胶膜柱或磁珠吸附从病毒样本中提取病毒RNA；3)进行RT-PCR扩增和荧光定量检测(结果可以根据Ct值进行解释)。在这种方法中，RNA提取试剂盒通常与病毒样品保存试剂盒及RT-qPCR检测试剂盒是相互分开的。另外，采集的样本中常含有RT-PCR聚合酶抑制剂，如果直接与PCR试剂混合，会阻碍核酸扩增。另外，通常情况下，病毒保存液需要在2-8度的条件下储存和运输，而常规RT-qPCR的检测试剂盒一般为液体制剂，需要-20摄氏度保存，且在运输过程中也需要冷藏(如用干冰)。病毒提取和PCR操作需要严格的生物安全标准以及实验室技术人员的经验和技能。最终的检测结果通常需要数小时才能得到。总的来说，上述传统的检测方法繁琐、复杂，容易出错。它们的低效率会严重限制社会对紧急情况，如SARS-CoV-2病毒的爆发时的响应速度和有效地应对，并可能导致我们所不希望对隔离和治疗感染患者的延迟。因此，本领域需要改进和简化的病毒RNA保存、提取和检测的配方、试剂盒和方法，以提高效率并降低出错概率。
技术实现思路
本专利技术提供了一种病毒保存液、核酸扩增反应制剂(可以为冻干粉形式)、基于qPCR的利用病毒保存液和核酸扩增反应制剂通过核酸扩增检测病毒的方法，以及含包括病毒保存液和核酸扩增反应制剂的PCR试剂盒。本专利技术的病毒保存液可以在室温下长时间保存病毒样品并防止RNA降解。该病毒保存液适于保存含有RNA病毒的病毒样品，例如冠状病毒，尤其是SARS-CoV-2病毒。样品溶液可直接与核酸扩增反应制剂联用，无需任何病毒核酸提取步骤而进行qPCR扩增，实现快速、高灵敏度的病毒检测。一方面，本专利技术提供一种病毒保存液，其包含牛血清白蛋白(BSA)、鱼胶、表面活性剂、pH缓冲液，该病毒保存液的pH值在8.0到8.5之间，例如，pH值8.0。pH缓冲液可包含TrisHCl。在一些实施例中，病毒保存液可进一步含KCl或MgCl2中的至少一种，或两者都包含。在一些实施例中，病毒保存液可进一步含二甲基亚砜(DMSO)和甘油中的至少一种或两者都包含。病毒保存液还可以进一步包含在PCR反应中抑制TaqDNA聚合酶抑制剂的抑制剂。在病毒保存液的一些实施例中，pH缓冲液包含Tris-HCl，并且在该溶液的总量中，Tris-HCl的摩尔浓度在10mM到200mM之间，BSA的质量浓度在1μg/μl到10μg/μl之间，鱼胶的质量百分比浓度在0.1％到2％之间。在一些实施例中，所述病毒保存液还包括KCl、MgCl2、DMSO和甘油，并且在该溶液的总量中，其中KCl的摩尔浓度在10mM到200mM之间，MgCl2的摩尔浓度在1.5到6mM之间，DMSO的体积百分比在0.1％到5％之间，甘油的体积百分比在1％～10％之间。另一方面，本专利技术提供一种核酸扩增反应溶液，其包含M-MLV逆转录酶(MMLV)、TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和荧光探针。核酸扩增反应溶液可进一步包含KCl和/或MgCl2、pH缓冲剂，例如Tris-HCl，以使溶液的pH保持在约8.0-8.5。所述核酸扩增反应溶液可进一步包括聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯。本专利技术还提供了一种通过冷冻干燥本文所述的核酸扩增反应溶液制备的冻干粉末。为了得到这种冻干粉末，核酸扩增反应液可以首先添加一种冻干保护剂，例如糖和/或PEG6000。再一方面，提供了一种制备用于PCR扩增的病毒样本的方法。该方法包括将病毒样品首先与本文所述病毒保存液混合，然后再加入本文所述的核酸扩增反应溶液，或核酸扩增反应溶液冻干粉，从而获得PCR样品溶液。当病毒是RNA病毒、优选冠状病毒、更优选SARS-CoV-2病毒时，该方法可进一步包括对PCR样品溶液进行qPCR。qPCR的热循环条件包括：逆转录反应：45℃-60℃，优选50℃-55℃，0.5min-10min，优选0.5min-1min；热变性反应：94℃-99℃，1s-60s；扩增反应：94℃-99℃2s-5s，55℃-60℃10s-45s，优选10s-30s，进行多个循环，优选至少35个循环，或至少40个循环。还有一方面，本专利技术提供了一种PCR扩增试剂盒，其包括存储在第一容器(例如一个小瓶)中的病毒保存液和在第二容器中如本文所述的核酸扩增反应制剂(溶液，或优选冻干粉末)。对于检测冠状病毒，例如SARS-CoV-2病毒，所述核酸扩增反应制剂可以包括适于其扩增和检测的引物和探针。该试剂盒进一步还可以包括含有已知核酸的阳性对照品，该已知核酸包含靶标的序列特征，以及含有不包含靶标序列特征的已知核酸的阴性对照品。具体实施方式本专利技术提供了病毒核酸保存液、核酸扩增反应制剂、含有病毒核酸保存液和核酸扩增反应制剂的试剂盒，以及制备和对病毒核酸进行PCR扩增的相关方法，能够快速，高灵敏度，准确地检测人类受试者的病毒感染情况。如本文所述，本专利技术的所有溶液(病毒保存液和核酸扩增反应溶液)都是水基的，这意味着除了明确提供或提及的成分外，其余的成分是水。在本文所述的所有组合物(溶液、冻干粉末)中，所述组合物的任何成分的量/浓度/百分比系指所述组分在总组合物中的最终数量/浓度/百分比。一方面，本专利技术提供了一种病毒保存液，其包含pH缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、鱼胶和表面活性剂，所述病毒保存液的pH值在8.0到8.5之间，例如在约8.0。在病毒保存液的一些实施例中，BSA的质量浓度可为1–10μg/μl，例如1–5μg/μl，并且鱼胶的质量百分比浓度可为0.1％–2％，例如，0.1％–1％。pH缓冲液可包括TrisHCl缓冲液，其在总病毒保存液中的量为10mM–200mM。在一些实施例中，病毒保存液可进一步包括氯化钾和/或氯化镁。氯化镁离子浓度可直接关系DNA聚合酶的活性和DNA双链的解链温度，对反应的特异性及产物有显著影响。如下文所述，KCl和/或MgCl2也可包括在核酸扩增反应制备中。在病毒保存液中，KCl的摩尔浓度为10mM–100mM，MgCl2的摩尔浓度为1.5mM–6mM。在一些实施例中，病毒保存液可进一步包括可抑制细菌生长的防腐剂，例如叠氮化钠(NaN3)、硫柳汞、抗生素、生物杀伤剂(如pro-clin300等)，和/或一种或多种螯合剂，例如EDTA、CDTA、HEDTA、EGTA和EDDA等，其可保护RNA不被降解。在一些实施例中，NaN3的浓度为溶液的0.01–0.1％(w/v)。在一些实施例中，EDTA的浓度可为0.1–5mM。在一些实施例中，病毒保存液可进一步包括二甲基亚砜和/或甘油。二甲基亚砜和甘油能促进核酸二级结构的打开，特别适用于GC含量高、二级结构复杂的模板扩增。二甲基亚砜的体积百分比可为0.1％-5％。甘油的体积本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种病毒保存液，包括：/n牛血清白蛋白、鱼明胶、表面活性剂、pH缓冲液，所述病毒保存液的pH值在8.0到8.5之间。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种病毒保存液，包括：
牛血清白蛋白、鱼明胶、表面活性剂、pH缓冲液，所述病毒保存液的pH值在8.0到8.5之间。


2.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述pH缓冲剂包含TrisHCl。


3.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液还包含一种螯合剂，优选EDTA。


4.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液还包含防腐剂，较佳为NaN3。


5.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液还包含：二甲基亚砜及甘油。


6.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液还包含：在PCR反应中抑制TaqDNA聚合酶抑制剂的抑制成分。


7.根据权利要求1所述病毒保存液，其特征在于，所述pH缓冲液包含TrisHCl，且在该溶液之总量中：
Tris-HCl的摩尔浓度在10mM到200mM之间，
牛血清白蛋白的质量浓度在1μg/μl到10μg/μl之间，并且
鱼明胶的质量百分比浓度在0.1％～2％之间。


8.根据权利要求7所述病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液还包含二甲基亚砜及甘油，且在该溶液之总量中：
二甲基亚砜的体积百分比在0.1％到5％之间，
甘油的体积百分比在1％到10％之间。


9.一种核酸扩增反应溶液，包括：
M-MLV逆转录酶(MMLV)、TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和荧光探针。


10.根据权利要求9所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含KCl。


11.根据权利要求9所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含MgCl2。


12.根据权利要求9所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯。


13.根据权利要求9所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含pH缓冲液。


14.根据权利要求9所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含KCl及聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，其中在该溶液已重配后并准备好进行qPCR反应的溶液总量中：
dNTP的浓度在0.05mM到0.5mM之间，
引物的浓度在0.05μM和0.5μM之间，
荧光探针的浓度为0.05μM和0.5μM之间，
MMLV的浓度在1U/μl和50U/μl之间，并且
TaqDNA聚合酶的浓度在0.1U/μl～3U/μl之间。


15.根据权利要求14所述核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述核酸扩增反应溶液还包含至少一种糖。


16.根据权利要求15所述的核酸扩增反应溶液，其特征在于，所述至少一种糖包括海藻糖或蔗糖，所述核酸扩增反应溶液进一步包含聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，当在所述溶液重配后并准备好进行qPCR反应时：
海藻糖的重量浓度在1％到1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春香，郭金海，肖欢欢，
申请(专利权)人：江苏康为世纪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32