基于CRISPR-Cas13a的牛病毒性腹泻病毒的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测牛病毒性腹泻病毒的引物、利用该引物制备的检测BVDV的试剂盒，以及基于CRISPR‑Cas13a的牛病毒性腹泻病毒的检测方法，引物为：5’‑GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCCAUCCAACGAACUCACCACUGUUGCU‑3’；试剂盒中至少包含上述引物，将待测样品加入到试剂盒中进行检测。本发明专利技术首次将CRISPR‑Cas13a体系成功用于BVDV病毒的核酸检测中，只需加入微量级的样品，就可以鉴定是否含有BVDV病毒。具有良好的特异性、灵敏度。该方法为BVDV的早期诊断提供了广阔的前景。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR-Cas13a的牛病毒性腹泻病毒的检测方法
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas13a的牛病毒性腹泻病毒的检测方法。
技术介绍
牛病毒性腹泻(粘膜病)是由牛病毒性腹泻病毒(BovineViralDiarrheaVirus，BVDV)引起的一种接触性传染病，主要感染牛，也感染猪、羊、骆驼等其他生物，宿主范围较广。BVDV是一种正义的核糖核酸(RNA)病毒，属于黄病毒科和瘟病毒属。感染后可导致多种临床表现，包括呼吸道，消化道和生殖(多种形式)的病症(B,RochFF,RichterV,etal.Ameta-analysisofbovineviraldiarrhoeavirus(BVDV)prevalencesintheglobalcattlepopulation[J].Scientificreports,2018,8(1):1-15.)。其中，以牛、羊的急性或慢性黏膜病、腹泻、生长繁殖障碍、免疫抑制和持续性感染等症状为主，一旦感染,直接影响牛的生长发育和繁殖，部分会出现免疫力下降等情况,这就可以诱发其他病原体的感染。由于BVDV的宿主极其广泛，包括多数野生动物均可感染BVDV,并可携毒、排毒，这就加大了散养动物感染BVDV的概率。因此，BVDV严重威胁我国甚至全球的畜牧业发展，造成全球极大的经济损失。所以BVDV的检测及预防有着十分重要的意义(GaroussiMT,MehrzadJ,NejatiA.Investigationofpersistentinfectionofbovineviraldiarrheavirus(BVDV)inHolsteindairycows[J].Tropicalanimalhealthandproduction,2019,51(4):853-858.)。目前，检测BVDV病毒的方法很多，包括传统的血清中和试验，免疫组化法，ELISA和最近的荧光PCR技术。然而，传统的BVDV方法几乎都需要精密的仪器和较高的成本很难应对现场和大规模检测，假阳性的概率也比较高(AdamsMJ,HendricksonRC,DempseyDM,etal.Trackingthechangesinvirustaxonomy[J].Archivesofvirology,2015,160(5):1375-1383.)。因此迫切需要建立一种快速，准确，高效的方法来检测BVDV。近几年发展起来的CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，规律成簇的间隔短回文重复)是出色的基因组编辑工具，其层出不穷的科研进展及其应用更新给生物学界造成革命性风暴，这也给病毒检测方面带来了巨大的应用前景。2015年，C2c2(Cas13a)结构被发现：包含一个识别结构域和两个HEPN核糖核酸酶结构域(Shmakov,S.,Abudayyeh,O.O.,Makarova,K.S.,Wolf,Y.I.,Gootenberg,J.S.,Semenova,E.,…Koonin,E.V.(2015).DiscoveryandFunctionalCharacterizationofDiverseClass2CRISPR-CasSystems.MolecularCell,60(3),385–397.)。随后，又有研究发现这两个结构域具有两种不同的RNA酶活性，一种作用于引导RNA(gRNA)，另一种作用于靶RNA(East-Seletsky,Alexandra,etal."TwodistinctRNaseactivitiesofCRISPR-C2c2enableguide-RNAprocessingandRNAdetection."Nature538.7624(2016):270-273.)。进一步探索发现，crRNA与靶标RNA互补形成双链后可与核酸叶(NUC)结合，结合使Cas13a发生显著的构想变化。RNA双链的形成触发HEPN1向HEPN2结构域移动，激活Cas13a蛋白的HEPN催化位点，使其以非特性方式裂解单链靶标和其它RNA(GootenbergJS,AbudayyehOO,LeeJW,EssletzbichlerP,DyAJ,JoungJ,VerdineV,DonghiaN,DaringerNM,FreijeCA,etal.NucleicaciddetectionwithCRISPR-Cas13a/C2c2.Science.2017；356:438-42.)。这种特异性识别核酸后出现的非靶标(附带效应)切割活性表明CRISPR/Cas生物学有望成为快速，准确和便携式的诊断工具。有报道，Gootenberg等发现，LeptotrichiawadeiCas13a(LwCas13a)激活的RNase活性可以检测样品中的寨卡病毒和登革热病毒(GootenbergJS,AbudayyehOO,KellnerMJ,JoungJ,CollinsJJ,ZhangF.MultiplexedandportablenucleicaciddetectionplatformwithCas13,Cas12a,andCsm6.Science.2018；360:439-44.)。Yafei等也利用CRISPR-Cas13a特异性检测PRRS(ChangY,DengY,LiT,etal.VisualdetectionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirususingCRISPR-Cas13a.[J].TransboundaryandEmergingDiseases,2020,67(2):564-571.)。随着检测技术的不断发展，利用CRISPR-Cas13a检测方法的优越性也逐渐凸显出来。CRISPR-Cas13a检测平台开发成为了RNA病毒病的检测的一种新的策略。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas13a的特异性好、灵敏度高，可以快速检测BVDV的方法。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采用的技术方案为：一种基于CRISPR-Cas13a的牛病毒性腹泻病毒的检测方法，包括LwCas13a原核表达载体的构建、LwCas13a的诱导表达纯化、特异性crRNA的设计、BVDV病毒RNA的提取、CRISPR-Cas13a检测体系的建立、结果判断，其具体步骤如下：LwCas13a原核表达载体的构建：LwCas13a全长基因通过PCR获得并通过酶切连接的方法克隆到pET-28a+载体上，构建pET-28a+-LwC13a重组表达载体；LwCas13a的诱导表达纯化：取上述原核表达载体转入RosettaTM(DE3)后扩大培养，通过IPTG在低温(18℃)诱导表达。收集细胞沉淀，过夜裂解后进行超声破碎，取超声后的上清液通过镍柱亲和层析法按照说明书步骤GE获得LwCas13a蛋白，SDS-PAGE验证，测定蛋白浓度后-80℃储存备用；特异性crRNA的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测牛病毒性腹泻病毒的引物，其特征在于：所述引物为：/n5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCCAUCCAACGAACUCACCACUGUUGCU-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测牛病毒性腹泻病毒的引物，其特征在于：所述引物为：
5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCCAUCCAACGAACUCACCACUGUUGCU-3’。


2.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于：
包含纯化的LwCas13a蛋白45nM、特异性crRNA22.5nM、淬灭荧光报告分子RNA125nM、RNase抑制剂2uL和检测缓冲液的总体积40uL；
所述特异性crRNA为权利要求1所述的引物；
所述淬灭荧光报告分子RNA为：5’-GAAGAAGAGUUUAUUCAGAUAGAUUUGU-3’，
5'端修饰为FAM，3'端修饰为BHQ-1。


3.如权利要求2所述的用于检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于：
纯化的LwCas13a蛋白纯化步骤如下：先构件LwCas13a原核表达载体，将LwCas13a编码基因克隆至原核表达载体pET-28a+上构建pET-28a+-LwCas13a重组表达载体，之后将pET-28a+-LwCas13a重组表达载体转入RosettaTM(DE3)扩大培养，低温诱导其表达LwCas13a蛋白，在通过镍柱亲和层析法获得纯化的LwCas13a蛋白。


4.一种基于CRISPR-Cas13a的牛病毒性腹泻病毒的检测方法，包括如下步骤：

【专利技术属性】
技术研发人员：倪伟，胡圣伟，姚瑞，李村院，李晓悦，徐越仁，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65