一种大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法，本发明专利技术以大黄鱼虹彩病毒LYCIV中的Laminin‑like保守区序列作为扩增靶序列，设计合成了一对特异性引物及对应的TaqMan探针，建立了LYCIV TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法，并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒，本发明专利技术引物和探针的序列如下：正向引物F：5’‑CGCTTGACCAAACAATCTTC‑3’；反向引物R：5’‑ATGAGCAATGGCGACCC‑3’；荧光探针Q：5’‑6‑FAM–CTTCTTCTGTTGCTGACTGTGGCGTGTACTC‑BHQ1‑3’。

【技术实现步骤摘要】
一种大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法
本专利技术涉及大黄鱼虹彩病毒的检测方法，特别涉及大黄鱼虹彩病毒（LargeYellowCroakerIridovirus，LYCIV）的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法。
技术介绍
大黄鱼虹彩病毒（LargeYellowCroakerIridovirus，LYCIV）是虹彩病毒科细胞肿大病毒属的成员，夏季高水温期为大黄鱼虹彩病毒病主要流行季节，高发期水温25℃-28℃，该病主要危害体长10cm左右的当年春苗，蔓延迅速，半个月内死亡率可达30%-50%。对于病毒性疫病，尚没有特效的治疗方法，病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。因此，建立快速灵敏实用的大黄鱼虹彩病毒PCR检测技术，不仅有助于及时对大黄鱼虹彩病毒进行诊断、监控和防治，减少经济损失，而且也是今后加强科学养殖管理，建立苗种检疫体系所必须的。目前，对大黄鱼虹彩病毒的检测主要采用透射电镜（TransmissionElectronMicroscope，TEM）观察和常规聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）检测等技术方法。但这些方法有的耗时长，操作繁琐，有的准确率不高，灵敏度低。而TaqMan探针法荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、TaqMan探针与DNA模板的高特异性杂交和光谱技术的敏感性及定量分析的优点，克服了常规PCR定性检测特异性差、准确率和灵敏度低的不足，极大地提高了检测的特异性、准确性和灵敏性。当前，荧光定量PCR技术已广泛应用于各种病毒的检测，如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒等，但还未见TaqMan探针法荧光定量PCR应用于大黄鱼虹彩病毒检测的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可特异性检测大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法。本专利技术所述大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒设有盒体、裂解液、吸附液、洗涤液、荧光定量PCR反应液、阳性对照和阴性对照。所述大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒的制备方法如下：1）制备盒体；2）配制检测试剂：裂解液：终浓度5mol/L盐酸胍，0.1mol/LEDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0；吸附液：由玻璃粉、浓硝酸与水组成，其中玻璃粉、浓硝酸与水的配比为1g：（5~6）mL：（10~12）mL，其中玻璃粉以质量计算，浓硝酸和水以体积计算，所述浓硝酸的质量分数可为55%~70%；洗涤液：终浓度0.1mol/L氯化钠，1mmol/LEDTA，10mmol/LTris-HCl，去离子水定容至1L，pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇；荧光定量PCR反应液：每19μL中包含2×定量PCR预混液10μL（TaKaRaPremixExTaq(probePCR）），正向引物F0.4μL，反向引物R0.4μL，6-FAM和BHQ1两端荧光标记的探针Q0.8μL，双蒸水7.4μL；阴性对照：灭菌超纯水；阳性对照：重组质粒pMD18-T-LYCIV-Laminin-like。3）将裂解液2、吸附液3、洗涤液4、操作说明书5、荧光定量PCR反应液6、阴性对照7、阳性对照8，置入盒体1内（参见图1），即得大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒。在步骤2）中，所述阳性对照的制备方法为：（1）引物设计，具体方法为：根据已公开的大黄鱼虹彩病毒基因组序列（GenBank登录号AY779031），采用PrimerPremier5设计能特异性鉴别大黄鱼虹彩病毒的正向引物F和反向引物R：正向引物F（SEQIDNO:1）5’-CGCTTGACCAAACAATCTTC-3’反向引物R（SEQIDNO:2）5’-ATGAGCAATGGCGACCC-3’（2）重组质粒pMD18-T-LYCIV-Laminin-like的构建步骤为：使用本专利技术设计的大黄鱼虹彩病毒Laminin-like基因引物，以大黄鱼虹彩病毒检测阳性的大黄鱼内脏组织样品DNA为模板，经过PCR反应，获得一段152bp的Laminin-like基因片段（SEQIDNO:3），然后将PCR产物电泳目的条带使用GelExtractionKit（OMEGA，USA）切胶回收并连接到pMD18-T载体（TaKaRa,Dalian,China）上，转化至Trans1-T1PhageResistant化学感受态细胞（TransGenBiotech，China）中，筛选阳性克隆并测序验证；Laminin-like基因片段序列如下：cgcttgaccaaacaatcttcacatccgtctctcgaggtaccccgcagctgagggtggtcgtctggttgtcgatttccaggttatagaaggtggtggcgtgagtacacgccacagtcagcaacagaagaagtagcagggtcgccattgctcat。（3）阳性对照的制备提取构建好的pMD18-T-LYCIV-Laminin-like质粒，用分光光度计检测质粒的质量和浓度，按照如下公式计算出目的基因的拷贝数，然后用灭菌超纯水稀释成浓度为1×108拷贝/μL，即为阳性对照。将该浓度质粒继续做10倍系列稀释，得1×107-1×102拷贝/μL质粒，用于制作标准曲线。。在步骤2）中，所述荧光定量PCR反应液中的荧光探针Q序列如下：荧光探针Q（SEQIDNO:4）5’-CTTCTTCTGTTGCTGACTGTGGCGTGTACTC-3’荧光探针Q（SEQIDNO:4）5’端标记6-FAM荧光基团，荧光探针3’端标记能够淬灭荧光基团所发射荧光信号的淬灭基团BHQ1。本专利技术所述大黄鱼虹彩病毒的检测方法包括以下步骤：1）选取待测样品，加入裂解液进行裂解；第1次离心，收集上清，加吸附液，混匀，静置后，第2次离心，收集沉淀物，用洗涤液洗涤沉淀物后，再第3次离心，再收集沉淀物，加水充分悬浮沉淀物，即得PCR模板；2）将步骤1）所得PCR模板1μL加入PCR反应液中进行荧光定量PCR反应，设立阳性对照和阴性对照，PCR反应的程序为：95℃25s；95℃5s，60℃35s，收集荧光信号，45个循环；3）PCR反应结束后，分析可视化荧光定量分析软件中扩增曲线，以标准曲线中Ct值大小判断病毒的有无。阴性对照应无Ct值，阳性对照Ct值<35，且出现S型典型扩增曲线。待测样品Ct值≤35且出现典型扩增曲线，可判定为阳性；若待测样品无扩增曲线，或Ct值>35，可判定为阴性。在步骤1）中，所述第1次离心可为12,000rpm，第1次离心时间可为3min;所述静置时间可为5min，静置期间摇匀1-3次；所述第2次离心可为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性鉴别大黄鱼虹彩病毒的引物和荧光探针，其序列如下：/n正向引物F：5’-CGCTTGACCAAACAATCTTC-3’；/n反向引物R：5’-ATGAGCAATGGCGACCC-3’；/n荧光探针Q：5’-CTTCTTCTGTTGCTGACTGTGGCGTGTACTC-3’；/n所述荧光探针Q的5’端标记6-FAM荧光基团，3’端标记能够淬灭荧光基团所发射荧光信号的淬灭基团BHQ1。/n

【技术特征摘要】
1.一种大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性鉴别大黄鱼虹彩病毒的引物和荧光探针，其序列如下：
正向引物F：5’-CGCTTGACCAAACAATCTTC-3’；
反向引物R：5’-ATGAGCAATGGCGACCC-3’；
荧光探针Q：5’-CTTCTTCTGTTGCTGACTGTGGCGTGTACTC-3’；
所述荧光探针Q的5’端标记6-FAM荧光基团，3’端标记能够淬灭荧光基团所发射荧光信号的淬灭基团BHQ1。


2.一种如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备盒体；
2）配制检测试剂：
裂解液：终浓度5mol/L盐酸胍，0.1mol/LEDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0；
吸附液：由玻璃粉、浓硝酸与水组成，其中玻璃粉、浓硝酸与水的配比为1g：5~6mL：10~12mL，所述浓硝酸的质量分数为55~70%；
洗涤液：终浓度0.1mol/L氯化钠，1mmol/LEDTA，10mmol/LTris-HCl，去离子水定容至1L，pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇；
荧光定量PCR反应液：每19μL中包含2×定量PCR预混液10μL，正向引物F0.4μL，反向引物R0.4μL，荧光探针Q0.8μL，双蒸水7.4μL；
阴性对照：灭菌超纯水；
阳性对照：重组质粒pMD18-T-LYCIV-Laminin-like；
3）将裂解液、吸附液、洗涤液、操作说明书、荧光定量PCR反应液、阴性对照、阳性对照，置入盒体内，即得大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒。


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【专利技术属性】
技术研发人员：陈新华，郭睿，何天良，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35