本发明专利技术提供了cfDNA末端修复酶组合物，包括如下几种酶：使cfDNA在dNTP存在下进行DNA双链修复及3’端加A的酶Ⅰ，所述的酶Ⅰ为Taq DNA聚合酶及Klenow Fragment，Exo‑；使cfDNA 5’端发生磷酸化修饰的酶Ⅱ，所述的酶Ⅱ为T4多聚核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase，简称T4 PNK）。本发明专利技术还提供了一种cfDNA末端修复缓冲液试剂。本发明专利技术还提供了使用上述的试剂进行cfDNA末端修复和构建cfDNA测序文库的方法。本发明专利技术具有如下技术效果：本发明专利技术的试剂酶用量少，成本低，且具有意想不到的更高的修复效率，适用于样本量较低的cfDNA进行末端修复。
【技术实现步骤摘要】
cfDNA末端修复的酶组合物、缓冲液试剂和测序文库的构建方法
本专利技术涉及一种cfDNA末端修复的酶组合物、缓冲液试剂和测序文库的构建方法，属于生物
技术介绍
血浆游离DNA(circulatingcellfreeDNA,cfDNA)是一种细胞外游离于体液中的DNA，cfDNA片段大小在150-400bp之间。cfDNA测序广泛应用于肿瘤疾病的诊断，产前筛查。鉴于血液中cfDNA含量较少，而且片段较短，限制了高通量测序的测序深度。因此，有必要通过提高cfDNA的末端修复及加A效率，保证建库效率，高通量测序数据能够覆盖到所有cfDNA，提高测序数据的真实性及可靠性。中国专利CN201480062608.5提供了一种用于DNA末端修复、腺苷酸化、磷酸化的酶组合物，所述组合物包含缺乏5'-3'和3'-5'外切核酸酶活性的经修饰的TaqDNA聚合酶，其与T4DNA聚合酶、Klenow片段和T4多核苷酸激酶和所有其它必要的组分包括反应缓冲液和三磷酸核苷预混，其为在一个管内并经两个步骤进行DNA钝化、磷酸化和单核苷酸延伸反应所需。中国专利CN201610040334.0公开了一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的方法及应用，具体涉及一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的方法及其应用，所述方法采用T4DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶和T4多核苷酸激酶的混合酶系。国际申请PCT/CN2016/106609(国际公布号：WO2018/090373A1)公开了一种DNA末端修复与加A的方法，该方法包括：在同一反应体系中，在dNTP存在下，利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平，利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基；在过量dATP存在下，利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在双链DNA3’末端加上dATP。上述专利都存在着一些不足，如酶用量较多，成本较高，或者不适用于样本量较低的cfDNA进行末端修复。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术所要解决的技术问题：提供一种新的cfDNA末端修复的酶组合物以及缓冲液试剂，来提高cfDNA末端平齐化及双链DNA3’端加A效率。本专利技术的技术构思如下：现有技术中DNA片段的末端修复可以使用klenowfragment、T4DNAPolymerase、TaqDNApolymerase、T4PolynucleotideKinase、KlenowFragment，Exo-。其中KlenowFragment保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。T4DNAPolymerase具有3'→5'外切酶活性，但不具有5'→3'外切酶活性，用于末端平齐化。由于KlenowFragment，Exo-没有外切酶活性，其在末端补平时经常会在3'末端额外加上1个或多个核苷酸，用于加A。TaqDNApolymerase具有5'→3'聚合酶活性，形成3’端带A的产物。cfDNA完整性较物理打断的基因组DNA高，末端修复酶混合液可在此基础上进行缩减。本研究选择KlenowFragment，Exo-、TaqDNAPolymerase、T4PolynucleotideKinase进行末端修复、5’端磷酸化修饰及3’端加A。经过末端平齐化的cfDNA3’端添加碱基A，以获得具有粘性末端A的cfDNA片段。末端平齐化所需的四种脱氧核糖核苷三磷酸很少，末端平齐化后通过KlenowFragment，Exo-为DNA双链的3’端添加碱基A，所以反应体系中dATP浓度对于cfDNA3’端加A效率影响较大。另外，专利技术人在研究上述问题时，在调整cfDNA末端修复缓冲液的过程中发现，改变缓冲液中三磷酸核苷dATP、dTTP、dCTP和dGTP比例时，末端修复效率会发生改变，dATP浓度会影响双链DNA5’端加A效率。基于上述发现，专利技术人提高末端修复缓冲液中dATP在其他三种脱氧核糖核苷三磷酸的占比，而不是同时加入四种等量的脱氧核糖核苷三磷酸，从而完成本专利技术。本专利技术的技术方案如下：cfDNA末端修复酶组合物，其特征在于，包括如下几种酶：使cfDNA在dNTP存在下进行DNA双链修复及3’端加A的酶Ⅰ，所述的酶Ⅰ为TaqDNA聚合酶及KlenowFragment，Exo-；使cfDNA5’端发生磷酸化修饰的酶Ⅱ，所述的酶Ⅱ为T4多聚核苷酸激酶(T4PolynucleotideKinase，简称T4PNK)。优选地，每50μL反应体系中含有：T4多聚核苷酸激酶2.5U；KlenowFragment，Exo-1U；TaqDNA聚合酶3U。本专利技术的cfDNA末端修复缓冲液试剂，包括Tris-Hcl、MgCl2、DTT、ATP、dATP、dGTP、dCTP和dTTP，其中的dATP浓度是dGTP、dCTP和dTTP各成分的浓度的5-10倍。优选地，每50微升反应体系中，末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：100-105mMTris-Hcl，18-20mMMgCl2，15-20mMDTT、18-20mMKCl、0.05-1％NP40、0.05-1％Tween20、1.5-2.5mMATP、0.2-0.5mMdGTP、0.2-0.5mMdCTP和0.2-0.5mMdTTP。更优选地，末端修复时，每50ul反应体系中加入5ul的10×末端修复缓冲液，所述的10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：组分含量Tris-Hcl(pH8.3)1MMgCl20.2MDTT0.2MKCl0.2MATP20mMdATP20mMdTTP2mMdCTP2mMdGTP2mMNP400.7％v/vTween-200.7％v/v本专利技术还提供了含有上述酶组合物以及上述缓冲液试剂的cfDNA末端修复试剂。本专利技术还提供了含有上述cfDNA末端修复试剂的cfDNA末端修复试剂盒。本专利技术还提供了含有上述cfDNA末端修复试剂的cfDNA建库试剂盒。使用上述cfDNA末端修复试剂进行cfDNA末端修复的方法，具体方法如下：在末端修复缓冲液试剂中用末端修复酶组合物处理cfDNA以产生末端平齐化且3’端加A的cfDNA；所述的末端修复反应体系的pH值为8.0～8.3左右；所述的反应条件为先在35～40℃反应10～15min；然后在60～70℃反应10～15min。优选地，所述的反应条件为先在37℃反应10min，然后在65℃反应15min。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.cfDNA末端修复酶组合物，其特征在于，包括如下几种酶：/n使cfDNA在dNTP存在下进行DNA双链修复及3’端加A的酶Ⅰ，所述的酶Ⅰ为Taq DNA聚合酶及Klenow Fragment，Exo-；/n使cfDNA 5’端发生磷酸化修饰的酶Ⅱ，所述的酶Ⅱ为T4多聚核苷酸激酶(T4Polynucleotide Kinase，简称T4 PNK)。/n
【技术特征摘要】
1.cfDNA末端修复酶组合物，其特征在于，包括如下几种酶：
使cfDNA在dNTP存在下进行DNA双链修复及3’端加A的酶Ⅰ，所述的酶Ⅰ为TaqDNA聚合酶及KlenowFragment，Exo-；
使cfDNA5’端发生磷酸化修饰的酶Ⅱ，所述的酶Ⅱ为T4多聚核苷酸激酶(T4PolynucleotideKinase，简称T4PNK)。
2.根据权利要求1所述的cfDNA末端修复酶组合物，其特征在于，每50μL反应体系中含有：T4多聚核苷酸激酶2.5U；KlenowFragment，Exo-1U；TaqDNA聚合酶3U。
3.cfDNA末端修复缓冲液试剂，其特征在于，包括Tris-Hcl、MgCl2、DTT、ATP、dATP、dGTP、dCTP和dTTP，其中的dATP浓度是dGTP、dCTP和dTTP各成分的浓度的5-10倍。
4.根据权利要求3所述的cfDNA末端修复缓冲液试剂，其特征在于，每50微升反应体系中，末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：100-105mMTris-Hcl，18-20mMMgCl2，15-20mMDTT、18-20mMKCl、0.05-1％NP40、0.05-1％Tween20、1.5-2.5mMATP、0.2-0.5mMdGTP、0.2-0.5mMdCTP和0.2-0.5mMdTTP。
5.根据权利要求3所述的cfDNA末端修复缓冲液试剂，其特征在于，末端修复时，每50ul反应体系中加入5ul的10×末端修复缓冲液，所述的10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：
组分
含量
Tris-Hcl(pH8.3)
1M
MgCl2
0.2M
DTT
0.2M
KCl
0.2M
ATP
20mM...
【专利技术属性】
技术研发人员：余丽萍，
申请(专利权)人：江苏康为世纪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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