乙型肝炎病毒核酸定量检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，具体步骤包括：采用乙型肝炎病毒‑核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒DNA，利用针对乙型肝炎病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测。整个试验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将血清或血浆标本直接加入PCR反应管中与乙型肝炎病毒‑核酸释放剂充分混合即可作为PCR扩增的模板，避免常规样本核酸提取过程中的环境污染，且整个步骤耗时短。本发明专利技术还提供一种用于乙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒，该试剂盒易于测定、操作方便。

【技术实现步骤摘要】
乙型肝炎病毒核酸定量检测方法及试剂盒
本专利技术涉及免疫学
，尤其涉及一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法及试剂盒。
技术介绍
乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，是急慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重要致病因子，也是全世界最严重的公共卫生问题之一。全球约20亿人被证明有乙肝感染，3.5亿人为慢性感染者。我国属于世界上HBV感染高发区，全国约1.3亿人是HBV携带者，慢性肝炎患者2300万，每年乙肝的发病率在6000万人次以上。在中国、东南亚和非洲等国家和地区，有约50%的肝硬化和70%-90%的肝癌，是由慢性HBV感染引起，而感染了HBV变异体的HBV携带者有7%-30%。乙肝病毒血清标志物(HBV-M)检测是诊断乙型肝炎最常用的指标,目前临床最常用的“两对半”指的是HBsAg、HBeAg、HBcAb、HBsAb、HBeAb，主要反映人体对乙肝病毒感染的免疫状态，但不能直接反映HBV在患者体内的复制情况，更不能作为判断患者是否具有传染性的直接证据。检测乙肝病毒DNA是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”，HBVDNA的检测是衡量乙肝传染性的最精确的指标，HBVDNA阳性即反映有完整的病毒颗粒的复制，是判断患者具有传染性的最直接和最可靠的指标，同时，HBVDNA还可作为判定HBV药物疗效的一个极有意义的临床指标。如果检测值大于1000或者1.0e+003拷贝/ML，说明乙肝病毒DNA呈阳性，提示HBV复制和有传染性。HBV-DNA越高表示病毒复制越厉害，传染性强。这对于乙肝治疗过程的监测，治疗效果的判断，治疗方案的制定都有着重要的意义。PCR法包括有巢式聚合酶链式反应(nestedPCR，nPCR)、多重PCR(mμLtiplexPCR，mPCR)、竞争性PCR(competitivePCR，cPCR)等多种方法。但都为定性检测方法，不能直接定量。目前临床常用的实时荧光定量PCR技术是把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测结合在一起，借助于荧光信号检测PCR产物，可解决传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题，但此方法定量不准确，并且操作时间久。
技术实现思路
由鉴于此，本专利技术确有必要提供一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法及试剂盒，以解决上述问题。本专利技术所采用的技术方案是：一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，具体步骤包括：采用乙型肝炎病毒-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒DNA，利用针对乙型肝炎病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针并配以PCR混合液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测；其中，所述乙型肝炎病毒-核酸释放剂包括氯化钾、十二烷基硫酸钠、环脂肽类生物表面活性剂或无水乙醇；所述PCR混合液包括乙型肝炎病毒-PCR反应液、乙型肝炎病毒-酶混合液和乙型肝炎病毒内标；所述PCR反应液包括引物、探针、dNTPs、Mg2+、PCRbutter；所述乙型肝炎病毒-酶混合液由Tap酶和UNG酶组成；所述乙型肝炎病毒内标包括阳性内对照扩增靶序列。基于上述，所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，具体包括以下步骤：将待测血清或血浆标本在3000rpm条件下离心1min，根据所述待测血清或血浆标本的数量，按照所述乙型肝炎病毒-PCR反应液38μL/人份、所述乙型肝炎病毒-酶混合液2μL/人份、所述乙型肝炎病毒内标0.2μL/人份配制所述PCR混合液，并在3000rpm条件下离心10S；然后先向每个PCR反应管中加入所述乙型肝炎病毒-核酸释放剂5μL，再分别加入所述待测血清或血浆、阴性对照、阳性对照以及定量参考品各5μL，吸打5～8次混匀；最后在向每个PCR反应管加入所述PCR混合液40μL，盖上管盖2000rpm离心30S；置于荧光定量PCR仪扩增，其中扩增循环条件设置为：第一步：UNG酶反应，50℃2分钟，1个循环；第二步：Tap酶活化，94℃5分钟，1个循环；第三步：包括变性、退火、延伸及荧光采集；变性，94℃5秒，45个循环；退火、延伸及荧光采集，57℃30秒，45个循环；第四步：仪器冷却，25℃10秒，1个循环。本专利技术还提供一种用于乙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒，该试剂盒含有以下组分：乙型肝炎病毒-核酸释放剂、乙型肝炎病毒PCR反应液、乙型肝炎病毒-酶混合液、乙型肝炎病毒内标。与现有技术相比，本专利技术提供的乙型肝炎病毒核酸定量检测方法具有突出的实质性特点和显著的进步，具体地，本专利技术所述提供的乙型肝炎病毒核酸定量检测方法及试剂盒，本试剂盒采用乙型肝炎病毒-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒DNA，利用针对乙型肝炎病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测。整个试验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将血清或血浆标本直接加入PCR反应管中与乙型肝炎病毒-核酸释放剂充分混合即可作为PCR扩增的模板，避免常规样本核酸提取过程中的环境污染。PCR检测体系含有UNG酶+dUTP防污染措施，将可能的产物污染充分降解，避免假阳性结果。PCR检测体系含有阳性内对照（乙型肝炎病毒内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。PCR检测体系含有内参比荧光ROX，用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参比荧光ROX的比值，使定量更准确。同时与现有技术相比在变性、退火、延伸阶段的耗时和对温度的要求均有所降低，降低了阶段耗时和最高温度要求。具体实施方式下面通过具体实施方式，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。实施例本实施例提供一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，具体步骤包括：采用乙型肝炎病毒-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒DNA，利用针对乙型肝炎病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR混合液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测；其中，所述乙型肝炎病毒-核酸释放剂包括氯化钾、十二烷基硫酸钠、环脂肽类生物表面活性剂或无水乙醇；所述PCR混合液包括乙型肝炎病毒-PCR反应液、乙型肝炎病毒-酶混合液和乙型肝炎病毒内标；所述PCR反应液包括引物、探针、dNTPs、Mg2+、PCRbutter；所述乙型肝炎病毒-酶混合液由Tap酶和UNG酶组成；所述乙型肝炎病毒内标包括阳性内对照扩增靶序列。具体地，所述乙型肝炎病毒核酸定量检测方法包括以下步骤：将待测血清或血浆标本在3000rpm条件下离心1min，根据待测血清或血浆标本的数量，按照PCR反应液38μL/人份+酶混合液2μL/人份+内标0.2μL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，具体步骤包括：采用乙型肝炎病毒-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒DNA，利用针对乙型肝炎病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针并配以PCR混合液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测；/n其中，所述乙型肝炎病毒-核酸释放剂包括氯化钾、十二烷基硫酸钠、环脂肽类生物表面活性剂或无水乙醇；/n所述PCR混合液包括乙型肝炎病毒-PCR反应液、乙型肝炎病毒-酶混合液和乙型肝炎病毒内标；/n所述PCR反应液包括引物、探针、dNTPs、Mg

【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，具体步骤包括：采用乙型肝炎病毒-核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒DNA，利用针对乙型肝炎病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针并配以PCR混合液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测；
其中，所述乙型肝炎病毒-核酸释放剂包括氯化钾、十二烷基硫酸钠、环脂肽类生物表面活性剂或无水乙醇；
所述PCR混合液包括乙型肝炎病毒-PCR反应液、乙型肝炎病毒-酶混合液和乙型肝炎病毒内标；
所述PCR反应液包括引物、探针、dNTPs、Mg2+、PCRbutter；
所述乙型肝炎病毒-酶混合液由Tap酶和UNG酶组成；所述乙型肝炎病毒内标包括阳性内对照扩增靶序列。


2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
将待测血清或血浆标本在3000rpm条件下离心1min，根据所述待测血清或血浆标本的数量，按照所述乙型肝炎病毒-...

【专利技术属性】
技术研发人员：童贻丽，杨恒宇，张婷，刘萍，李淑淑，
申请(专利权)人：郑州迪安图医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41