中药抗非酒精性脂肪肝活性物质的筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种以线粒体自噬关键调控蛋白Parkin为靶点的集“识别‑分离‑鉴定”于一体的筛选新方法，实现从中药等复杂样品中高效筛选Parkin调节剂，发现抗NAFLD先导化合物，并为揭示中药调节Parkin而发挥抗NAFLD作用的药效物质提供依据。

【技术实现步骤摘要】
中药抗非酒精性脂肪肝活性物质的筛选方法
本申请涉及一种抗非酒精性脂肪肝活性物质的筛选方法，尤其涉及以线粒体自噬蛋白Parkin为靶的中药抗非酒精性脂肪肝活性物质的筛选方法。
技术介绍
非酒精性脂肪肝(Nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)已经成为重大健康威胁，它不仅会引发肝脏严重病变乃至癌化，还可能引发肝外肿瘤、糖尿病、心血管及代谢疾病，且加快它们的病程。NAFLD病因不同于酒精性脂肪肝，在全球患病人群数量庞大，国内约有近1/3的人群患有NAFLD。随着生活方式的迅速转变，我国NAFLD发展趋势日益加重，且呈年轻化趋势。NAFLD的威胁在全球都存在被低估的现象，且目前没有药物干预的手段，只能通过改善饮食、运动等习惯进行调理，尚缺乏治疗NAFLD特效药物。研究NAFLD防治药物具有重要价值。线粒体自噬(Mitophagy)是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程。通过选择性地清除受损或功能不完整的线粒体，维持线粒体功能完整性和细胞生存，达到延缓衰老、治疗疾病的目的。近期研究表明线粒体自噬与NAFLD密切相关，2009年Nature首次报道了自噬调节脂质代谢，随后2018年CellDeath&Disease报道了线粒体自噬在NAFLD中的作用。Pink1/Parkin通路介导的线粒体自噬途径，可高效选择清除受损的线粒体，并促进线粒体增殖以维持线粒体正常生理功能。因此，Pink1/Parkin通过对线粒体的调控对相关疾病有极大的相关性。Pink1/Parkin介导线粒体自噬分子机制：1)正常情况下，蛋白激酶Pink1在胞质中合成后通过线粒体膜分子通道进入线粒体内部，被线粒体内蛋白水解酶降解；2)线粒体受损致内膜电位消散，Pink1向内膜转移受阻，稳定并积累在线粒体外膜上；3)Parkin作为一种E3泛素连接酶，被Pink1从胞质中招募到线粒体外膜并使其发生磷酸化而激活；4)被激活的Parkin催化线粒体蛋白发生泛素化，使之能被接头蛋白识别；5)泛素化的蛋白与吞噬膜上酵母自噬蛋白8家族同源蛋白如微管相关蛋白轻链3、高尔基体相关ATP酶增强子等连接，形成线粒体自噬体；6)线粒体自噬体与溶酶体融合形成成熟线粒体自噬溶酶体，启动线粒体降解程序。中药作为天然来源化合物库，其中包含的化合物由于结构的多样性、毒性较低和来源广泛等特点，长期以来一直是新药或先导化合物发现的重要来源。目前上市药物中，如紫杉醇、吗啡、青蒿素、青霉素以及大部分抗生素和半合成抗生素等，都是直接来源于天然产物或以天然产物为先导化合物通过结构改造而成。目前已发现中药可影响Pink1/Parkin通路而调节线粒体自噬，如，厚朴提取液通过Parkin蛋白表达调控以改善泛素蛋白酶体系统功能活性，从而保护黑质区多巴胺能神经元；从中药中分离的白藜芦醇、远志皂苷、槲皮素等亦能影响Pink1/Parkin通路而调节线粒体自噬。因此，从中药及天然药物中搜寻Parkin调节剂是最有效、最直接的途径。众所周知，中药是一个复杂体系，其组成成分数量庞大，种类繁多，使得中药活性成分分析和筛选非常困难。经典筛选方法是：首先从中药中提取分离、制备得到纯度较高的单体化合物；然后将化合物进行体内外药理实验验证，通过检测Parkin表达量或酶活性及线粒体自噬的变化情况来反映化合物是否有效。可见，传统方法不能直接从复杂体系中筛选活性成分，筛选成本高，劳动强度高，效率低，样品用量大、动物消耗量大及筛选周期较长等缺点。为此，我们需建立不经分离纯化，能直接从中药复杂体系中快速有效找到Parkin调节剂的新方法。亲和超滤是由亲和采集与超滤技术结合而成，采用超滤膜分离与生物大分子(>10kD的蛋白和DNA)相结合的小分子化合物，目前已成为筛选研究中药中作用于生物大分子(如蛋白、酶、DNA等)的活性成分的有效途径之一。LC/MS技术具备高分离、高灵敏度、高选择性以及提供丰富结构信息等优点，目前已用LC/MS技术对大部分常用中药的化学成分进行了分析、鉴定，用LC/MS可实现活性成分的结构鉴定分析。因此，本研究拟联合亲和超滤与LC/MS(GC/MS)，构建一种以Parkin为靶的集“识别-分离-鉴定”于一体的中药活性组分筛选新方法；用所建方法筛选中药中Parkin活性调节剂；并通过测定Parkin酶活力证实其对Parkin的调节作用(激动/拮抗)；最后用细胞实验测试化合物对NAFLD的缓解作用。研究结果无疑将揭示所筛中药结合于Parkin的主要活性物质，为NAFLD及其他线粒体自噬相关疾病防治新药的研发提供先导物，并为揭示中药调节线粒体自噬而发挥药效的物质基础提供充分科学依据；所建筛选方法将为中药及天然药物复杂体系中的Parkin调节剂的快速、有效筛选开辟新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种以线粒体自噬关键调控蛋白Parkin为靶点的集“识别-分离-鉴定”于一体的筛选新方法，实现从中药等复杂样品中高效筛选Parkin调节剂，发现抗NAFLD先导化合物，并为揭示中药调节Parkin而发挥抗NAFLD作用的药效物质提供依据。具体的，本专利技术提供以下方案：一种抗非酒精性脂肪肝活性物质的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：1)分别将含有活性物质的待分析液和空白对照液与Parkin蛋白混悬液充分混合，含有活性物质的待分析液混合形成混合液A，空白对照液混合形成混合液B，采用水浴孵育；2)分别在混合液A和混合液B中加入PBS，离心，保留沉淀C和沉淀D；3)在所述沉淀C和沉淀D中分别加入有机溶剂，使Parkin蛋白变性，离心，保留上清液获得上清液E和上清液F；4)分别对上清液E和上清液F微孔滤膜过滤，获得滤过液G和滤过液H；5)采用HPLC/MS对滤过液G和滤过液H进行分析；6)当滤过液G中的色谱峰面积显著高于(ΔP>20％)滤过液H中的色谱峰面积时，该色谱峰所对应的活性物质即为抗非酒精性脂肪肝活性物质；ΔP＝(Pe–Pc)/Pe×100，Pe为滤过液G色谱峰面积，Pc为滤过液H色谱峰面积。进一步的，步骤1)中Parkin蛋白混悬液采用PH7.4的PBS溶液混悬；步骤1)中Parkin蛋白悬液的蛋白浓度为0.5-1.5g/L；步骤2)中水浴孵育条件为35-39℃水浴中孵育30-120min；步骤2)中加入PBS前增加离心步骤，以弃去未与Parkin蛋白相互结合的成分；该离心步骤的离心条件是0-6℃条件下，10000-20000×g离心10-60min；步骤2)和3)中离心条件是0-6℃条件下，10000-20000×g离心10-60min；步骤3)中有机溶剂为80％甲醇，采用超声方式使Parkin蛋白变性；步骤3)重复完成2-5次，以充分洗去未与Parkin蛋白相互结合的成分；步骤4)中在上清液E和上清液F微孔滤膜过滤前增加先吹干后再加入80％甲醇复溶的步骤；步骤4)中采用0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选抗非酒精性脂肪肝活性物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)分别将含有活性物质的待分析液和空白对照液与Parkin蛋白混悬液充分混合，含有活性物质的待分析液混合形成混合液A，空白对照液混合形成混合液B，采用水浴孵育；/n2)分别在混合液A和混合液B中加入PBS，离心，保留沉淀C和沉淀D；/n3)在所述沉淀C和沉淀D中分别加入有机溶剂，使Parkin蛋白变性，离心，保留上清液获得上清液E和上清液F；/n4)分别对上清液E和上清液F微孔滤膜过滤，获得滤过液G和滤过液H；/n5)采用HPLC/MS对滤过液G和滤过液H进行分析；/n6)当滤过液G中的色谱峰面积显著高于(ΔP>20％)滤过液H中的色谱峰面积时，该色谱峰所对应的活性物质即为抗非酒精性脂肪肝活性物质；/nΔP＝(Pe–Pc)/Pe×100，Pe为滤过液G色谱峰面积，Pc为滤过液H色谱峰面积。/n

【技术特征摘要】
1.一种筛选抗非酒精性脂肪肝活性物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)分别将含有活性物质的待分析液和空白对照液与Parkin蛋白混悬液充分混合，含有活性物质的待分析液混合形成混合液A，空白对照液混合形成混合液B，采用水浴孵育；
2)分别在混合液A和混合液B中加入PBS，离心，保留沉淀C和沉淀D；
3)在所述沉淀C和沉淀D中分别加入有机溶剂，使Parkin蛋白变性，离心，保留上清液获得上清液E和上清液F；
4)分别对上清液E和上清液F微孔滤膜过滤，获得滤过液G和滤过液H；
5)采用HPLC/MS对滤过液G和滤过液H进行分析；
6)当滤过液G中的色谱峰面积显著高于(ΔP>20％)滤过液H中的色谱峰面积时，该色谱峰所对应的活性物质即为抗非酒精性脂肪肝活性物质；
ΔP＝(Pe–Pc)/Pe×100，Pe为滤过液G色谱峰面积，Pc为滤过液H色谱峰面积。


2.一种筛选能与Parkin蛋白结合的活性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)分别将含有活性物质的待分析液和空白对照液与Parkin蛋白混悬液充分混合，含有活性物质的待分析液混合形成混合液A，空白对照液混合形成混合液B，采用水浴孵育；
2)分别在混合液A和混合液B中加入PBS，离心，保留沉淀C和沉淀D；
3)在所述沉淀C和沉淀D中分别加入有机溶剂，使Parkin蛋白变性，离心，保留上清液获得上清液E和上清液F；
4)分别对上清液E和上清液F微孔滤膜过滤，获得滤过液G和滤过液H；
5)采用HPLC/MS对滤过液G和滤过液H进行分析；
6)当滤过液G中的色谱峰面积显著高于(ΔP>20％)滤过液H中的色谱峰面积时，该色谱峰所对应的活性物质即为能与Parkin蛋白结合的活性成分；
ΔP＝(Pe–Pc)/Pe×100，Pe为滤过液G色谱峰面积，Pc为滤过液H色谱峰面积。


3.如权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于：步骤1)中Parkin蛋白混悬液采用PH7.4的PBS溶液混悬；步骤1)中Parkin蛋白悬液的蛋白浓度为0.5-1.5g/L。


4.如权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于：步骤2)中水浴孵育条件为35-39℃水浴中孵育30-120min；步骤2)中加入PBS前增加离心步骤，以弃去未与Parkin蛋白相互结合的成分；该离心步骤的离心条件是0-6℃条件下，10000-20000×g离心10-60min。


5.如权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于：步骤2)和3)中离心条件是0-6℃条件下，10000-20000×g离心10...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞捷，杨兴鑫，张美，顾雯，李凤娇，
申请(专利权)人：云南中医药大学，
类型：发明
国别省市：云南;53