一种氨基酸稳定氮同位素的测量方法及其应用技术

本发明专利技术属于氨基酸稳定氮同位素的测定技术领域，公开了一种氨基酸稳定氮同位素的测量方法及其应用，该方法是将氨基酸溶解于碱性无机溶液中涡旋震荡，再加入醇类有机溶液和氯甲酸异丁酯、有碱性有机溶液进行衍生化反应，得到衍生化的氨基酸粗品，然后加入饱和氯化钠溶液和二氯甲烷进行萃取分离得到上层溶液，氮气吹干，加入二氯甲烷进行定容，制得衍生化的氨基酸溶液，将其通过自动进样器进入气相色谱分离、进入燃烧还原管转化形成N

【技术实现步骤摘要】
一种氨基酸稳定氮同位素的测量方法及其应用
本专利技术属于稳定氮同位素的测定
，更具体地，涉及一种氨基酸稳定氮同位素的测量方法及其应用。
技术介绍
氨基酸是微生物和动植物所需的基本营养物质，其代谢过程会使氨基酸氮同位素发生分馏现象，因而通过测定氨基酸稳定氮同位素值可以了解氨基酸代谢组学过程和溯源分析。由于氨基酸含有羧基、羟基和氨基等极性较大基团，使其挥发性相对较弱，需要衍生化后的氨基酸才通过气相色谱-燃烧-同位素比值质谱仪测定氨基酸稳定氮同位素。过去测定氨基酸稳定氮同位素的衍生化方法通常使用硅烷化法和酰基化等，衍生化的氨基酸再通过气相色谱-燃烧-同位素比值质谱仪测定氨基酸稳定氮同位素比值(刘瑀等，2018，环境化学,037,239-248；徐春英等，2009，中国农业科学，02,77-84)。但由于这些衍生化所需反应温度到达110℃或者反应时间需要1～2h。一种在常温条件下、反应迅速、操作简单的衍生化方法能够实现快速分析需求，通过有机溶剂快速萃取氨基酸衍生化产物，吸取氨基酸衍生化产物通过气相色谱-燃烧-同位素比值质谱仪测定氨基酸稳定氮同位素比值。
技术实现思路
为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，提供一种氨基酸稳定氮同位素的测量方法。该方法过程简单，效率高，重现性好，可实现快速、可靠的测试氨基酸标准样品、微生物和动植物的氨基酸稳定氮同位素。本专利技术的另一目的在于提供上述方法的应用，该方法可用于氨基酸标准样品、微生物和动植物的氨基酸稳定氮同位素测定。本专利技术的目的通过下述技术方案来实现：一种氨基酸稳定氮同位素的测量方法，包括如下具体步骤：S1.将粉末状氨基酸样品溶解于碱性无机溶液中涡旋震荡，得到溶液A,再将醇类有机溶液和氯甲酸异丁酯加入溶液A中涡旋震荡，得到溶液B，然后加入碱性有机溶液和氯甲酸异丁酯后涡旋震荡，得到衍生化的氨基酸粗品；S2.在衍生化的氨基酸粗品中加入饱和NaCl溶液和二氯甲烷充分混合后静置，将上层溶液分离后40～50℃用氮气吹干，制得衍生化的氨基酸；S3.将二氯甲烷加入至衍生化的氨基酸中，移至顶空瓶中，制得衍生化的氨基酸溶液；S4.将衍生化的氨基酸溶液通过自动进样器进入气相色谱分离、进入燃烧还原管转化形成N2，经过液氮冷肼装置去除水分，进入Isoprime100稳定同位素比质谱仪，测定氨基酸稳定氮同位素的比值。优选地，步骤S1中所述的溶液A中粉末状氨基酸的质量和碱性无机溶液的体积比为(1～5)mg：(100～200)μL；所述碱性无机溶液的浓度为5～12mol/L。优选地，步骤S1中所述醇类有机溶液、氯甲酸异丁酯和溶液A的体积比为(2～4)：(1～2)：(2～4)。优选地，步骤S1中所述溶液B、碱性有机溶液和氯甲酸异丁酯的体积比为(5～10)：(2～4)：(1～2)。优选地，步骤S1中所述醇类有机溶液为无水乙醇或异丙醇。优选地，步骤S1中所述碱性有机溶液为吡啶、三甲胺或三乙胺。优选地，步骤S1中所述涡旋震荡的转速为1000～8000r/min；所述涡旋震荡的时间为3～5min。优选地，步骤S2中所述衍生化的氨基酸、饱和NaCl溶液和二氯甲烷的体积比为(8～16)：(5～10)：(5～10)。优选地，步骤S3中所述二氯甲烷和衍生化的氨基酸的用量比为500μl：(0.1～5)mg。所述的方法在检测氨基酸标准样品、微生物或动植物中氨基酸稳定氮同位素中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术的氨基酸衍生化反应时间小于1h，衍生化的过程不需要加热，在常温条件下可以发生。2.本专利技术的方法操作过程简单，效率高，重现性好，可实现快速、可靠的测试氨基酸标准样品、微生物、和动植物的氨基酸稳定氮同位素。附图说明图1为实施例1中氨基酸衍生化反应的流程示意图。图2为实施例1中氨基酸衍生化产物稳定氮同位素测量过程。图3为实施例1中脯氨酸的气相色谱-燃烧-同位素比值质谱仪测定稳定氮同位素值。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。实施例11.称取5mg的标准粉末状氨基酸置于试剂瓶内，用移液枪量取200μL的12mol/L氢氧化钠溶液至试剂瓶中，在常温条件将混合溶液在漩涡混合器以转速为1000r/min涡旋震荡5min，使氨基酸充分溶解于氢氧化钠溶液中，制得氨基酸溶液。2.在氨基酸溶液中加入200μL的异丙醇和100μL氯甲酸异丁酯，在常温条件下，以转速为1000r/min涡旋震荡5min，再加入200μL的吡啶和100μL氯甲酸异丁酯，以转速为1000r/min涡旋震荡5min，制得衍生化的氨基酸粗品；3.在衍生化的氨基酸粗品中加入500μL饱和NaCl溶液和500μL二氯甲烷充分混合后静置，静置后的上层衍生化后氨基酸溶液移至透明试剂瓶内，在40℃条件下用干燥氮气吹干，再加入500μL二氯甲烷，移至顶空瓶中，制得衍生化的氨基酸溶液。4.通过自动进样器将衍生化的氨基酸进入气相色谱分离(色谱条件:HP-5毛细管柱30m×0.32mm×0.25μm；进样口温度：250℃；载气：高纯氦气；流速1.0ml/min；升温程序：初始温度80℃，保持2min，10℃/min升至140℃，保持1min，4℃/min升至240℃，保持1min，5℃/min升至280℃，保持5min)进入燃烧还原管(Cu还原管，加热温度950℃)转化形成N2，经过液氮冷肼装置去除水分，进入Isoprime100稳定同位素比质谱仪，测定氮同位素比值。图1为实施例1中氨基酸衍生化反应的流程图。从图1可知，氨基酸衍生化的操作过程简单，衍生化反应过程不需要加热，可提高衍生化过程的工作效率。图2为实施例1中氨基酸衍生化产物稳定氮同位素测量过程。从图2可知，进样操作过程简单，由电脑程序控制自动进样。图3为实施例1中脯氨酸的气相色谱-燃烧-同位素比值质谱仪测定稳定氮同位素值。从图3可知，在656秒出现脯氨酸氮同位素的峰值，说明本专利技术氨基酸衍生化方法可以测定稳定氮同位素的比值。实施例21.称取1mg的标准粉末状氨基酸置于试剂瓶内，用移液枪量取200μL的5mol/L氢氧化钠溶液至试剂瓶中，在常温条件将混合溶液在漩涡混合器以转速为8000r/min涡旋震荡3min，使氨基酸充分溶解于氢氧化钠溶液中，制得氨基酸溶液。2.在氨基酸溶液中加入200μL的无水乙醇和100μL氯甲酸异丁酯，在常温条件下，以转速为8000r/min涡旋震荡3min，再加入200μL三甲胺和100μL氯甲酸异丁酯，以转速为8000r/min涡旋震荡3min，制得衍生化的氨基酸粗品；3.在衍生化的氨基酸粗品中加入50本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氨基酸稳定氮同位素的测量方法，其特征在于，包括如下具体步骤：/nS1.将粉末状氨基酸样品溶解于碱性无机溶液中涡旋震荡，得到溶液A，再将醇类有机溶液和氯甲酸异丁酯加入溶液A中涡旋震荡，得到溶液B，然后加入碱性有机溶液和氯甲酸异丁酯后涡旋震荡，得到衍生化的氨基酸粗品；/nS2.在衍生化的氨基酸粗品中加入饱和NaCl溶液和二氯甲烷充分混合后静置，将上层溶液分离后40～50℃用氮气吹干，制得衍生化的氨基酸；/nS3.将二氯甲烷加入至衍生化的氨基酸中，移至顶空瓶中，制得衍生化的氨基酸溶液；/nS4.将衍生化的氨基酸溶液通过自动进样器进入气相色谱分离、进入燃烧还原管转化形成N

【技术特征摘要】
1.一种氨基酸稳定氮同位素的测量方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
S1.将粉末状氨基酸样品溶解于碱性无机溶液中涡旋震荡，得到溶液A，再将醇类有机溶液和氯甲酸异丁酯加入溶液A中涡旋震荡，得到溶液B，然后加入碱性有机溶液和氯甲酸异丁酯后涡旋震荡，得到衍生化的氨基酸粗品；
S2.在衍生化的氨基酸粗品中加入饱和NaCl溶液和二氯甲烷充分混合后静置，将上层溶液分离后40～50℃用氮气吹干，制得衍生化的氨基酸；
S3.将二氯甲烷加入至衍生化的氨基酸中，移至顶空瓶中，制得衍生化的氨基酸溶液；
S4.将衍生化的氨基酸溶液通过自动进样器进入气相色谱分离、进入燃烧还原管转化形成N2，经过液氮冷肼装置去除水分，进入Isoprime100稳定同位素比质谱仪，测定氨基酸稳定氮同位素的比值。


2.根据权利要求1所述的氨基酸稳定氮同位素的测定方法，其特征在于，步骤S1中所述的溶液A中粉末状氨基酸的质量和碱性无机溶液的体积比为(1～5)mg：(100～200)μL；所述碱性无机溶液的浓度为5～12mol/L。


3.根据权利要求1所述的氨基酸稳定氮同位素的测定方法，其特征在于，步骤S1中所述醇类有机溶液、氯甲酸异丁酯和溶液A的体积比为(2～4)：(1～2)：(2～4)。
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【专利技术属性】
技术研发人员：林钦浩，安太成，李桂英，熊举坤，梁志梳，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44