一种人血浆中同型半胱氨酸的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种人血浆中同型半胱氨酸的检测方法及试剂盒，步骤如下：在人血浆样品中依次加入同型半胱氨酸同位素内标溶液、碱溶液和还原剂溶液后，混匀并在室温下孵育，再加入蛋白沉淀剂溶液，震荡离心后，取上清液进样分析，用高效液相色谱‑三重四极杆质谱仪进行检测，本发明专利技术检测方法前处理简单、检测成本低、特异性和抗基质干扰能力强，检测LOQ较常规方法进一步降低。

【技术实现步骤摘要】
一种人血浆中同型半胱氨酸的检测方法及试剂盒
本专利技术涉及一种人血浆中同型半胱氨酸的检测方法及试剂盒，属于生物检测领域。技术背景同型半胱氨酸Hcy又称高半胱氨酸，是体内蛋氨酸循环和半胱氨酸代谢的中间产物，并能回转成蛋氨酸，或经过转硫途径而回转为半胱氨酸。正常血浆总同型半胱氨酸浓度一般在5-15μmol/L，平均浓度大约为10μmol/L。血浆总同型半胱氨酸浓度越高，患心脑血管疾病(如冠心病)，动脉粥样硬化，肾功能障碍和糖尿病的风险越高。心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液粘稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。心脑血管疾病的常见指标有血清脂质、C反应蛋白(CRP)和同型半胱氨酸(Hcy)。当人体的新陈代谢出现障碍时，同型半胱氨酸由于无法降解而在体内聚集。高浓度的同型半胱氨酸会对血管内壁造成损害，使血管内膜增厚、粗糙，形成斑块，进而使管腔狭窄甚至阻塞，动脉供血不全，导致动脉粥样硬化和冠心病的发生。同型半胱氨酸Hcy、半胱氨酸Cys和甲硫氨酸(Met,也称蛋氨酸)是体内甲硫氨酸循环的3个重要产物。正常情况下，同型半胱氨酸通过两条途径转化：一是再甲基化，约50％的同型半胱氨酸在甲硫氨酸合成酶的催化作用下，以叶酸作为甲基供体，发生甲基化，重新合成甲硫氨酸。二是转硫基途径，另外约50％的同型半胱氨酸在胱硫醚β合成酶的作用下，最终生成半胱氨酸。现有的临床心脑血管疾病血液标志物同型半胱氨酸的检测方法大多采用生化免疫法等，方法的特异性和准确度较低，无法满足较高的要求。针对上述情况，本专利技术提出了一种基于高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术快速检测血浆中同型半胱氨酸的方法，为心脑血管疾病的风险预估和个性化干预提供了便利且精准的线索。
技术实现思路
针对上述技术问题，专利技术人提供了一种人血浆中同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取人血浆样品100μL，分别加入10-100μL10-50μmol/L高胱氨酸-d8溶液、10-30μL碱溶液和20-100μL二硫苏糖醇溶液，混匀，室温下孵育10-20min；2)向步骤1)所述溶液中加入500-1000μL蛋白沉淀剂，混匀，离心；3)取步骤2)离心后上清液进样，采用高效液相色谱-三重四极杆质谱仪检测，获得所述同型半胱氨酸检测结果，所述高效液相方法条件如下：色谱柱Agilentporoshell120EC-C18，2.1×50mm，2.7μm；色谱柱柱温25-35℃；进样量为1-5μL；流速为0.1-0.3mL/min；流动相的体积比为0.1％甲酸水:0.1％甲酸甲醇，90～99:10～1。常规做法是使用DTT进行Hcy的还原，但据现有文献报道，DTT的还原能力取决于其所处体系的酸碱度，因此申请人选用了NaOH、KOH和氨水进行还原能力的检测，并通过后期方法学进行系统适应性等相关测定。专利技术人发现碱性溶液可以提高DTT的还原能力，因此碱性溶液可以选用NaOH、KOH和氨水。专利技术人在进行碱性溶液筛选时意外发现，氨水能够显著提高DTT的还原能力，相同DTT量的情况下，加入氨水可以缩短还原孵育的时间，虽然NaOH、KOH为强碱，但其含有金属离子，无法应用于质谱检测，易残留于仪器中，而采用氨水作为碱性溶液后，不仅提高DTT的还原能力，缩减孵育时间到10-20min，优选15min，并且不伤害质谱仪。本专利技术所采用的技术为加入稀氨水的DTT还原反应，并且孵育时间为15min，见实验结果。另外其他专利文件记载，有研究人员未加入NaOH溶液，直接用DTT溶液进行血浆孵育10min，但通过专利技术人验证，孵育时间是不足以充分还原Hcy，其检测结果由于Hcy还原程度不完全，结果可靠性不高。专利技术人优选使用稀氨水，由于浓氨水具有挥发性和本专利技术中氨水加入体积小的特点，稀氨水更具有操作性，推荐浓度为所述碱溶液为1-5％氨水，优选2.5％。孵育完毕，再进行蛋白沉淀(在本方法体系里，避免使用三氯乙酸作为蛋白沉淀剂，因为使用三氯乙酸的谱图中有一个很大的色谱峰，另外，长期使用进行检测，三氯乙酸会腐蚀色谱仪部件，而用0.1％甲酸乙腈溶液则没有相关问题)，因此，在本专利技术中，所述蛋白沉淀剂为0.05-0.5％甲酸的乙腈溶液，优选0.1％甲酸的乙腈溶液。所述液相条件为：色谱柱：Agilentporoshell120EC-C18，2.1×50mm，2.7μm；色谱柱柱温：30℃；进样量：1μL；流速：0.2mL/min；流动相：0.1％甲酸水:0.1％甲酸甲醇98:2。考虑到正常人血浆或血清中同型半胱氨酸的含量在5～15μmol/L，本方法进样量小，为1μL，LOQ已经达到1μmol/L，这是可以准确定量下的最低浓度(该1μmol/L是考虑到正常人血浆或血清中同型半胱氨酸含量为5～15μmol/L的条件下所尝试的最低浓度)，如果采用信噪比S/N≥5，本专利技术LOD将达到0.02μmol/L，因此本液相方法实际上也具有高灵敏度。在上述检测方法中，所述三重四极杆质谱仪的检测方法采用正离子模式，并采用多反应监测MRM的扫描方式，所述多反应监测MRM的参数如下：所述质谱中的质谱离子源参数如下：电离源：AJS-ESI电离源气帘气温度：250℃气帘气流速：9.0L/min喷雾气压力：35psi鞘气温度：325℃鞘气流速：12.0L/min毛细管电压：3500V喷嘴电压：300V。本专利技术中，在未特殊说明情况下，均为室温进行。0.1％甲酸甲醇和0.1％甲酸水，0.1％甲酸乙腈溶液，百分数指的均为体积百分数。所述溶液，在未特殊说明情况下，均为水溶液。专利技术的创新点：本专利技术通过加入碱溶液(1-5％氨水溶液)，使得DTT在碱性环境下还原性增强，孵育反应时间缩短为15min(如果常规不加碱溶液时，即只加DTT溶液做还原剂时，即使提高DTT的浓度，还原时间一般也要30min)，本专利技术使得血浆的前处理时间缩短。和加入氢氧化钠或氢氧化钾水溶液的方法相比，本方法的氨水溶液在电离源中不会留下金属离子残留物，对质谱仪器损害更小，而氢氧化钠或氢氧化钾溶液(或其他碱金属溶液)中的钠离子或钾离子会残留在仪器中，对仪器检测有一定的影响和干扰，此外本方法的灵敏度比加入氢氧化钠溶液的方法的灵敏度提高了2-5倍，优选3倍左右。相比目前已报道的其他的液相色谱-三重四极杆质谱法检测同型半胱氨酸的方法，本专利技术不需要进行固相萃取设备和操作，检测成本更低，前处理时间短，满足临床检测需求。具体实施方式实施例1检测人血浆中同型半胱氨酸的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：同型半胱氨酸校准品，同型半胱氨酸质控品，同型半胱氨酸同位素内标溶液，碱溶液，还原剂溶液，蛋白沉淀剂溶液，0.1％的甲酸水溶液，0.1％的甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人血浆中同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)取人血浆样品100μL，分别加入10-100μL 10-50μmol/L高胱氨酸-d8溶液、10-30μL碱溶液和20-100μL二硫苏糖醇DTT水溶液，混匀，室温下孵育10-20min；/n2)向步骤1)所述溶液中加入500-1000μL蛋白沉淀剂，混匀，离心；/n3)取步骤2)离心后上清液进样，采用高效液相色谱-三重四极杆质谱仪检测，获得所述同型半胱氨酸检测结果，所述高效液相方法条件如下，/n色谱柱Agilent poroshell 120 EC-C18，2.1×50mm，2.7μm；/n色谱柱柱温25-35℃；/n进样量1-5μL；/n流速0.1-0.3mL/min；/n流动相体积比0.1％甲酸水:0.1％甲酸甲醇为90～99:10～1。/n

【技术特征摘要】
1.一种人血浆中同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取人血浆样品100μL，分别加入10-100μL10-50μmol/L高胱氨酸-d8溶液、10-30μL碱溶液和20-100μL二硫苏糖醇DTT水溶液，混匀，室温下孵育10-20min；
2)向步骤1)所述溶液中加入500-1000μL蛋白沉淀剂，混匀，离心；
3)取步骤2)离心后上清液进样，采用高效液相色谱-三重四极杆质谱仪检测，获得所述同型半胱氨酸检测结果，所述高效液相方法条件如下，
色谱柱Agilentporoshell120EC-C18，2.1×50mm，2.7μm；
色谱柱柱温25-35℃；
进样量1-5μL；
流速0.1-0.3mL/min；
流动相体积比0.1％甲酸水:0.1％甲酸甲醇为90～99:10～1。


2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述碱溶液为1-5％氨水。


3.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，所述氨水浓度为2.5％。


4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述二硫苏糖醇水溶液为0.1-0.5mol/L。


5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，所述二硫苏糖醇水溶液为0.3mol/L。


6.根据权利要求1所述检测方...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱学庆，秦炜，吴小虎，贺笑非，
申请(专利权)人：上海润达榕嘉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31