【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种来源于鳞毛蕨属植物间苯三酚类化合物在制备冠状病毒3clpro靶蛋白抑制剂的用途及制备方法。
技术介绍
1、黑足鳞毛蕨（ dryopteris fuscipes c. chr.）、大羽鳞毛蕨( dryopteris wallichiana(spreng.) hyl.)、变异鳞毛蕨( dryopteris varia(l.) kuntze)、半育鳞毛蕨( dryopteris sublacerachrist)、红盖鳞毛蕨( dryopteris erythrosora(d. c. eaton)kuntze)、粗齿鳞毛蕨( dryopteris juxtapositachrist)，均是鳞毛蕨科、鳞毛蕨属陆生中型蕨类常绿植物，分布于中国江苏、云南、贵州、四川、浙江等地，在日本、朝鲜和中南半岛也有分布。鳞毛蕨属植物的全草可药用，有清热解毒，目赤肿痛，疮疡溃烂，久不收口，生肌敛疮之功效。
2、冠状病毒于1960年被发现，在人类和野生动物中广泛存在。目前已知有7种冠状病毒可引起人类疾病，包括人冠状病毒229e（hcov-229e）、人冠状病毒oc43（hcov-oc43）、人冠状病毒nl63（hcov-nl63）、人冠状病毒hku1（hcov-hku1）、严重急性呼吸综合征
3、冠状病毒遗传物质是所有rna病毒中最大的，基因组全长在26～32 kb之间。病毒基因组5'端约2/3为重叠的开放阅读框(open reading frame，orf) orf1a和orf1b，主要负责编码与病毒复制和转录相关的酶等非结构蛋白。后面的1/3基因组负责编码刺突蛋白(spikeprotein，s)、小膜蛋白(envelope membrane protein，e)、膜蛋白(membraneprotein，m)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，n)等主要结构蛋白，另外还有嵌套在3'端基因组中的一系列基因编码辅助性蛋白，有研究对首次公布的sars-cov-2基因组进行了注释，发现其编码至少27种蛋白质，其中包括16种非结构蛋白，4种结构蛋白(s，e，m和n)以及8种附属蛋白，基因组类似sars-cov，但仍存在一些编码蛋白质序列的插入和缺失，其中3clpro（也称mpro）结构蛋白至关重要，决定了病毒的组装、稳定性和侵袭力。
4、冠状病毒蛋白酶nsp5（3clpro或mpro）是一种约30 kda的三域半胱氨酸蛋白酶，在所有已知的冠状病毒中的结构和功能中保持，是复制酶多蛋白（pp1a和pp1ab）蛋白水解处理的主要蛋白酶。主蛋白酶（mpro）在冠状病毒基因表达和复制酶处理中的关键作用，其具有催化底物的特异性和核心结构同源性。在冠状病毒中，同一属nsp5蛋白酶通常表现出超过80%的序列一致性，而不同属的蛋白酶的发散性要大得多，序列接近50%一致。sars-cov和sars-cov-2蛋白酶的序列分析显示，在整个蛋白酶的结构中，只有12个氨基酸存在差异（约96%的序列一致），不一致氨基酸大多远离活性位点，因此针对3clpro蛋白酶的抑制剂研究有较强的药物研发前景。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供间苯三酚类化合物的抑制冠状病毒用途及制备方法，进而提供抑制冠状病毒3clpro靶蛋白的抗病毒药物，该间苯三酚类化合物对冠状病毒3clpro靶蛋白具明显的抑制作用。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供了一种间苯三酚类化合物的抑制冠状病毒3clpro靶蛋白的用途，该间苯三酚类化合物的结构式如下所示：
3、；
4、该类成分在鳞毛蕨属植物中的lc/ms表征见图9。图9为黑足鳞毛蕨、大羽鳞毛蕨、变异鳞毛蕨、半育鳞毛蕨、红盖鳞毛蕨、粗齿鳞毛蕨乙醚提物uplc-q-tof-ms/ms正总离子流图以及化合物识别。方法：lc-ms分析所用仪器为安捷伦(agilent, germany) 生产的g6545b lcms-q-tof仪。液相色谱仪控制器型号为g7114b和g7129b，泵型号为g7129-60090，自动进样器型号为g7129a/b。色谱柱为安捷伦eclipse plus c18柱（2.1×50 mm），柱温30℃。流动相a：甲酸/水 （0.05/100，v/v,），b：乙腈（100，v），流速为0.2 ml/min，梯度洗脱条件：5%-100% b，0-15 min。质谱条件：离子源为esi源，三氟乙酸钠校正，电喷雾正负离子分别检测。
5、所述冠状病毒包括：sars-cov-2、hcov-nl63、hcov-229e。
6、间苯三酚类化合物的制备方法为：将黑足鳞毛蕨属植物（以黑足鳞毛蕨提取为例）以有机溶剂作为提取溶剂通过浸渍提取、回流提取、渗漉提取、微波提取和超声提取中任意一种方式提取，将提取液浓缩，得到浓缩液；浓缩后用硅胶柱层析，梯度洗脱，洗脱液为正己烷：乙酸乙酯，体积比为100: 0、20: 1、10: 1、5: 1；1: 1；0: 100。收集组分，得到组分1~组分6。
7、将组分4经hplc反向柱，流动相为体积比5: 95～100: 0的甲醇：水，4ml/min，后经硅胶柱层析，洗脱液为正己烷-乙酸乙酯，体积比为50: 1-1: 1，纯化获得间苯三酚类化合物1。
8、将组分4经经hplc反向柱，流动相为体积比5:95～100:0的甲醇：水，4ml/min，后经硅胶柱层析，洗脱液为正己烷：二氯甲烷，体积比为20: 1-1: 1，后经hplc welch ultimatexb-c18，流动相体积比为80: 20的甲醇-水，2.0ml/min，纯化得间苯三酚类化合物2。
9、将组分4经hplc反向柱，流动相为体积比5:95～100:0的甲醇：水，4ml/min，后经硅胶柱层析，洗脱液为正己烷-乙酸乙酯，体积比为50：1-1：1，后经hplc welch ultimate xb-c18，流动相体积比为75: 25的甲醇-水，纯化获得间苯三酚类化合物3、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10。
10、将组分3经过经硅胶柱层析，洗脱液为正己烷-乙酸乙酯，体积比100: 0-1: 2，后经sephadex lh-20凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷=1: 1，再经过hplc welchultimate xb-c18柱子，流动相为体积比为28:72的水甲醇，2.3 ml/min，纯化获得间苯三酚类化合物4、化合物5、化合物6、化合物11。
【技术保护点】
1.间苯三酚类化合物在制备冠状病毒3CLpro靶蛋白抑制剂的用途，其特征在于，间苯三酚类化合物的结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述间苯三酚类化合物为黑足鳞毛蕨的提取物，来源于黑足鳞毛蕨、大羽鳞毛蕨、变异鳞毛蕨、半育鳞毛蕨、红盖鳞毛蕨、粗齿鳞毛蕨、黑足鳞毛蕨。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的冠状病毒为SARS-CoV-2、HCoV-NL63或HCoV-229E。
4.权利要求1或2或3中所述的用途，其特征在于，所述的间苯三酚类化合物的制备方法为：
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的制备方法中，研究蕨类采用冷凝或回流提取的方式提取。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的制备方法中，有机溶剂选自乙醚、丙酮、乙酸乙酯、乙醇和甲醇中任意一种或两种以上。
【技术特征摘要】
1.间苯三酚类化合物在制备冠状病毒3clpro靶蛋白抑制剂的用途，其特征在于，间苯三酚类化合物的结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述间苯三酚类化合物为黑足鳞毛蕨的提取物，来源于黑足鳞毛蕨、大羽鳞毛蕨、变异鳞毛蕨、半育鳞毛蕨、红盖鳞毛蕨、粗齿鳞毛蕨、黑足鳞毛蕨。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的冠状病毒为sars-cov-2...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯博，白同尘，张荣平，陈兴龙，倪广惠，周堂，林芷淇，朱红波，
申请(专利权)人：云南中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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