一种检测腐霉利的试纸条及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测腐霉利的试纸条及方法。该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有腐霉利半抗原Ⅰ‑载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有腐霉利单克隆抗体‑胶体金标记物，所述腐霉利单克隆抗体是以腐霉利半抗原Ⅱ‑载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。本发明专利技术还提供一种应用上述试纸条检测蔬菜、水果中腐霉利的方法。本发明专利技术提供的试纸条具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、适于大批量样本筛查等优点，能够满足我国食品监管部门开展现场监控和检测工作。

【技术实现步骤摘要】
一种检测腐霉利的试纸条及方法
本专利技术涉及一种检测腐霉利的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测腐霉利的胶体金试纸条，其特别适用于蔬菜、水果中腐霉利残留的检测。
技术介绍
腐霉利(procymidone)，是一种广谱内吸性低毒杀菌剂，主要用于果蔬、花卉等植物的灰霉病、菌核病、褐腐病、大斑病、黑星病的防治。腐霉利有很强的刺激作用，对皮肤和眼睛的正常合成和代谢，一旦进入人体，会干扰或抑制物质的内分泌系统，具有对人体健康的影响。我国国家标准GB2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定了蔬菜、水果中腐霉利的残留限量为0.2～10mg/kg。目前已报道的检测腐霉利的方法主要是气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱串联质谱法等仪器方法。这些方法均须在实验室条件下操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用过程中有很大的限制性，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适用于蔬菜水果中腐霉利残留的胶体金试纸条，可满足大量样品现场筛选和监控，能够更好地满足我国食品监管部门等开展检测工作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够检测蔬菜、水果中腐霉利残留的胶体金试纸条，并且提供一种高效、准确、简便、适于现场监控和大量样本筛查的检测方法。本专利技术所提供的检测腐霉利的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；所述反应膜上具有包被有腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述结合物释放垫上喷涂有腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物，所述腐霉利单克隆抗体是以腐霉利半抗原Ⅱ-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；所述腐霉利半抗原Ⅰ是由羟基腐霉利与琥珀酸酐反应得到，其具有式(Ⅰ)所示的结构；所述腐霉利半抗原Ⅱ是在碱性条件下，将3,5-二氯-4-氟硝基苯与发生亲核取代反应后，将产物进行加氢还原反应，然后再与1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸、草酰氯发生环化反应得到，其具有式(Ⅱ)所示的结构：其中，n为-CH2基团数目，n为0～4的整数。所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：1)制备喷涂有腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；2)制备具有包被有腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。具体地说，步骤包括：1)将羟基腐霉利与琥珀酸酐反应，制备腐霉利半抗原Ⅰ；在碱性条件下，将3,5-二氯-4-氟硝基苯与发生亲核取代反应后，将产物进行加氢还原反应，然后再与1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸、草酰氯发生环化反应，制备腐霉利半抗原Ⅱ；2)将腐霉利半抗原Ⅰ和腐霉利半抗原Ⅱ分别与载体蛋白偶联，制备腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物、腐霉利半抗原Ⅱ-载体蛋白偶联物；3)用腐霉利半抗原Ⅱ-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌腐霉利单克隆抗体的杂交瘤细胞株；4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；5)分别将腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(T)和质控线(C)上；6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；7)将制备的腐霉利单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物；8)将腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；9)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白、pH为7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖。最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下保存12个月。本专利技术的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测蔬菜、水果中腐霉利残留的方法，它包括步骤：(1)样品前处理；(2)用试纸条进行检测；(3)分析检测结果。本专利技术的腐霉利快速检测试纸条采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层析分析技术，将腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的腐霉利在流动过程中与结合物释放垫上的腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的腐霉利半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有腐霉利残留。检测时，样品经处理后滴入试纸条卡孔内，当腐霉利在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的腐霉利半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T)和质控线(C)上各出现一条红色条带，且T线显色比C线显色深或与C线显色一致；如果腐霉利在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与腐霉利全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与腐霉利半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比C线显色浅。如图5所示。阴性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T)同时也显示出红色条带，且(T)线颜色接近或深于(C)线时，判为阴性。阳性：当质控线(C)显示出红色条带，而检测线(T)不显色或(T)线颜色浅于(C)线时，判为阳性。无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。本专利技术创造性地将两种不同结构的腐霉利半抗原分别与载体蛋白偶联后制得腐霉利免疫原和腐霉利包被原，这样更有利于建立起具有高灵敏度的测定腐霉利的间接竞争免疫分析方法；本专利技术的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；用本专利技术试纸条检测腐霉利残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。附图说明图1为腐霉利半抗原Ⅰ、腐霉利半抗原Ⅱ分子结构图。图2为腐霉利半抗原Ⅰ合成图。图3为腐霉利半抗原Ⅱ合成图。图4为试纸条剖面结构示意图。图5为试纸条检测结果判定图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1检测腐霉利的试纸条本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测腐霉利的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物，所述腐霉利单克隆抗体是以腐霉利半抗原Ⅱ-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；其特征在于所述腐霉利半抗原Ⅰ是由羟基腐霉利与琥珀酸酐反应得到，其具有式(Ⅰ)所示的结构；所述腐霉利半抗原Ⅱ是在碱性条件下，将3,5-二氯-4-氟硝基苯与

【技术特征摘要】
1.一种检测腐霉利的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有腐霉利半抗原Ⅰ-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有腐霉利单克隆抗体-胶体金标记物，所述腐霉利单克隆抗体是以腐霉利半抗原Ⅱ-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；其特征在于所述腐霉利半抗原Ⅰ是由羟基腐霉利与琥珀酸酐反应得到，其具有式(Ⅰ)所示的结构；所述腐霉利半抗原Ⅱ是在碱性条件下，将3,5-二氯-4-氟硝基苯与发生亲核取代反应后，将产物进行加氢还原反应，然后再与1,2-二甲基环丙烷-1,2二羧酸、草酰氯发生环化反应得到，其具有式(Ⅱ)所示的结构：



其中，n为-CH2基团数目，n为0～4的整数。

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小胜，马玉华，崔海峰，王健，朱亮亮，刘玉梅，何方洋，冯才伟，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，山东勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11