一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条及其应用，属于兽医生物诊断制品的生产和技术领域。该试纸条包括设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，检测线处包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体；质控线处包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白。样本稀释液含有量子点微球标记的重组蛋白MGF360和重组蛋白CD2v；重组蛋白MGF360的序列如SEQ ID NO:4；重组蛋白CD2v的序列如SEQ ID NO:2。采用本发明专利技术试纸条和样本稀释液检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体，可用于非洲猪瘟感染的早期检测，且特异性强，灵敏度高，稳定性好。

【技术实现步骤摘要】
一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条及其应用
本专利技术属于兽医生物诊断制品的生产和
，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条及其应用。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)感染引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，是我国一类动物疫病，也是世界动物卫生组织(OIE)法定报告动物疫病。ASFV是一种复杂的、有囊膜的、双股DNA病毒，直径170～190kb，具有末端交联和反转重复区，其编码151-167种蛋白，成熟的病毒粒子包含有约50多种结构蛋白。ASFV主要经呼吸道和消化道途径侵入猪体，猪体应答感染，除了血清中产生特异性的IgG抗体外，在呼吸道与消化道黏膜还可产生特异性的sIgA抗体。sIgA抗体主要存在于呼吸道分泌液、唾液、泪液、乳汁、胃肠分泌液和泌尿生殖道分泌液中，是机体黏膜免疫的主要抗体，也是病原体侵入后最先产生的免疫反应，常用作疾病感染早期诊断的检测指标。因此，猪感染ASFV后，其黏膜表面分泌的特异性sIgA抗体是作早期诊断的理想靶标。目前针对ASFV防控尚无有效的商品化疫苗，因此疫情防控的监测与诊断变得至关重要。传统的诊断检测非洲猪瘟病毒抗体的方法有间接免疫荧光(IFA)、和酶联免疫法(ELISA)。其中IFA的敏感性偏低，需要荧光操作人员和荧光显微镜，成本高昂，限制了在现场快速检测中的应用。ELISA以抗原抗体特异性反应为原理检测动物是否具有非洲猪瘟病毒抗体，具有灵敏度高，特异性强等优点，但操作较为繁琐，耗时较长，加之需要酶标仪、恒温箱等设备，在基层养殖场难以展开实时检测。
技术实现思路
针对现有问题的不足，本专利技术的第一个目的是提供一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条，可用于非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的快速、高特异性、高灵敏度的定性检测。本专利技术的第二个目的是提供配合该检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条的样本稀释液。本专利技术的第三个目的是提供以非诊断为目的的检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的方法，该方法操作简单，无需经过专业的培训，可以很好地胜任各种现场、基层实验室等环境下的检测；结合较荧光显微镜和酶标仪价格更为低廉的紫外光发射器，可以及时的，方便的，在现场得到结果。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条，包括设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线处包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体；所述质控线处包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白；所述非洲猪瘟阳性血清是将重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360免疫兔子后所得。在本专利技术中，所述非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白是将非洲猪瘟阳性血清采用proteinG纯化试剂盒纯化后所得蛋白；所述鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体是由分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11所制备，所述杂交瘤细胞株4H11的保藏号为：CCTCCNO：C201526。在本专利技术中，所述试纸条还包括样品垫，所述样品垫是将玻璃纤维膜采用含有酪蛋白和Tween-20的PBS缓冲液浸泡处理后所得。本专利技术还提供配合所述试纸条使用的样本稀释液，含有量子点微球标记的重组蛋白MGF360和量子点微球标记的重组蛋白CD2v；所述重组蛋白MGF360的序列如SEQIDNO:4所示；所述重组蛋白CD2v的序列如SEQIDNO:2所示。在本专利技术中，将量子点微球分别与重组蛋白MGF360和重组蛋白CD2v偶联，分别得到量子点微球标记的重组蛋白MGF360和量子点微球标记的重组蛋白CD2v；然后将量子点微球标记的重组蛋白MGF360和重组蛋白CD2v按照体积比为1：0.5-1.5混合，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物；将所述非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物与含有酪蛋白和Tween-20的PBS缓冲液按照体积比1:10-20混合，得到样本稀释液。在本专利技术中，所述量子点微球与重组蛋白MGF360的质量比为3-5:1，所述量子点微球与重组蛋白CD2v的质量比为3-5:1；所述PBS缓冲液含有0.2-1.0％的酪蛋白和0.1-0.3％的Tween-20。本专利技术还提供一种以非诊断为目的的采用所述试纸条和所述样本稀释液检测非洲猪瘟病毒黏膜抗体的方法：将拭子样品加入样本稀释液中孵育后，滴加在试纸条的样品垫，反应后，采用紫外光发射器检测C线和T线。在本专利技术中，所述拭子样品包括口拭子、鼻拭子、肛拭子和肺泡灌洗液。通过量子点微球标记的重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360与拭子样品中对应的特异性非洲猪瘟黏膜抗体sIgA结合，检测线处包被的抗猪SC蛋白单克隆抗体捕获量子点微球标记的重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360与特异性非洲猪瘟黏膜抗体sIgA的复合物，质控线处包被的非洲猪瘟阳性血清纯化蛋白捕获过剩的量子点微球标记的重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360，并通过量子点微球发光显色。本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：1.本专利技术检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条，由于量子点微球具有均一度高，单分散性好，稳定性强等优点，因此使用量子点微球作为标记物制作的试纸条批次间差异较小；2.本专利技术检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条，制备方法简单，操作易上手，所需原料简单，可在较短时间内掌握，有广阔的市场前景和较大的经济收益。3.采用本专利技术试纸条和样本稀释液检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体，可用于非洲猪瘟感染的早期检测，且特异性强，灵敏度高，稳定性好。4.采用本专利技术试纸条和样本稀释液检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体，检测方法操作简单，无需经过专业的培训，可以很好地胜任各种现场、基层实验室等环境下的检测；结合较荧光显微镜和酶标仪价格更为低廉的紫外光发射器，可以及时的，方便的，在现场得到结果。5.采用本专利技术试纸条和样本稀释液，可用于鉴别动物所产生的非洲猪瘟抗体是源于非洲猪瘟基因缺失株产生的抗体还是野毒感染后所产生的抗体。附图说明图1是本专利技术实施例1重组蛋白CD2v的表达鉴定图，其中泳道1是纯化后的重组蛋白CD2v，泳道2是纯化后的重组蛋白CD2v和非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的Western-bloting鉴定，M为蛋白maker。图2是本专利技术实施例1重组蛋白MGF360的表达鉴定图，其中泳道1是纯化后的重组蛋白MGF360，泳道2是纯化后的重组蛋白MGF360和非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的Western-bloting鉴定，M为蛋白maker。图3是本专利技术检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条的结构示意图，其中，1-检测非洲猪瘟病毒CD2v和MGF360黏膜抗体的试纸条，2-底板，3-样品垫、4-硝酸纤维本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条，其特征在于包括设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线处包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体；所述质控线处包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白；所述非洲猪瘟阳性血清是将重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360免疫兔子后所得。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测非洲猪瘟病毒CD2v与MGF360黏膜抗体的试纸条，其特征在于包括设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线处包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体；所述质控线处包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白；所述非洲猪瘟阳性血清是将重组蛋白CD2v和重组蛋白MGF360免疫兔子后所得。


2.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于所述非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白是将非洲猪瘟阳性血清采用proteinG纯化试剂盒纯化后所得蛋白；所述鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体是由分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11所制备，所述杂交瘤细胞株4H11的保藏号为：CCTCCNO：C201526。


3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于：所述试纸条还包括样品垫，所述样品垫是将玻璃纤维膜采用含有酪蛋白和Tween-20的PBS缓冲液浸泡处理后所得。


4.配合权利要求1-3之一所述试纸条使用的样本稀释液，其特征在于所述样本稀释液含有量子点微球标记的重组蛋白MGF360和量子点微球标记的重组蛋白CD2v；所述重组蛋白MGF360的序列如SEQIDNO:4所示；所述重组蛋白CD2v的序列如SEQIDNO:2所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯志新，刘斐，白昀，李佳豪，陈蓉，张磊，韦艳娜，张越，李悦，刘蓓蓓，华利忠，谢青云，熊祺琰，邵国青，单衍可，陆雨楠，王丽，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32