一种临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂和制备工艺制造技术

本发明专利技术公开再生医学技术领域的一种临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂和制备工艺。具体包括：取离体活性支气管刷检组织进行消化处理，终止消化后收集细胞；利用铺被滋养层细胞的培养板对消化后细胞进行铺板培养，收集细胞并利用铺被滋养层细胞的培养板对其进行扩增培养，待细胞长满至培养板表面积的50％‑90％时，进行传代培养；待传代培养细胞长满至培养皿表面积的85％‑95％时，消化并收集贴壁细胞，洗涤即可。本发明专利技术首次确定适用于肺脏损伤修复的临床级细胞，并通过选择合适的制备工艺实现了该细胞的工业化制备，可在短期内获得满足临床细胞治疗数量和质量的支气管基底层细胞，该方法制得的支气管基底层细胞进入病灶后可稳定分化，实现对肺脏的明显修复。

【技术实现步骤摘要】
一种临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂和制备工艺
本专利技术涉及再生医学
，具体涉及一种临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂和制备工艺。
技术介绍
肺脏是一个由上皮细胞和其它类型细胞共同构成的复杂器官，发挥着呼吸的重要功能。在执行呼吸任务的过程中，特别是当接触到一些外来的或内在的有害物质时，例如大气污染物、细菌病毒或血液中的毒性物质，肺内的细胞会大量死亡并诱发炎症反应，从而导致大规模的肺部组织损伤。这种大规模的损伤往往会引发各种肺部疾病，如慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管扩张(BE)和肺纤维化等。慢性阻塞性肺病(简称“慢阻肺”，COPD)是一类慢性气道阻塞性疾病的统称。这是一类发病率和死亡率都较高的疾病。最新统计数据表明，在我国40岁以上人群中，有超过11％的人患有不同程度的慢阻肺。换言之，在我国有超过4000万慢阻肺患者，而其中每年有超过60万人因此而死亡。慢阻肺发病学的中心环节是吸烟和其他有害气体或吸入颗粒刺激导致的慢性气道炎症，支气管由于慢性炎症造成粘膜肿胀、上皮细胞坏死、腺体增生、粘液增多、支气管扭曲塌陷，发生肺气肿时肺泡结构破坏、肺弹性降低。慢阻肺的临床表现为：慢性咳嗽、咳痰，严重时出现呼吸困难，活动能力降低，最终发展为慢性肺源性心脏病和慢性呼吸衰竭，导致丧失劳动能力和生活自理能力，甚至死亡。其临床特点为不完全可逆的气流受限，且病情呈进行性加重。目前临床上普遍采取的治疗方法是长期吸入长效M受体阻滞剂(LAMA)和/或长效β2受体激动剂+吸入型的糖皮质激素(LABA+ICS)，同时辅以抗炎、祛痰和氧疗。但以上传统治疗方法仅为对症处理，未能从根本上解决肺部结构损毁的问题。肺减容术作为治疗终末期肺气肿的治疗方法，其开展的时间尚短，适应证及疗效均不明确，发生并发症几率较高。支气管扩张(BE)是由于支气管及其周围肺组织慢性化脓性炎症和纤维化，使支气管壁的肌肉和弹性组织破坏，导致支气管变形及持久扩张，患者的肺组织病理损伤不可逆。支气管扩张病程多呈慢性经过，可发生于任何年龄。典型症状为慢性咳嗽，咳大量脓痰和反复咯血，发展中国家的发病率明显高于发达国家。目前研究认为感染，先天性和遗传性疾病，纤毛异常，免疫缺陷，异物吸入等因素是引起支气管扩张的病因。在我国，支气管扩张的治疗目前仍集中在对症治疗及抗生素应用等，治疗手段单一，无法真正重建受损的肺组织结构，因此也无法恢复肺部的正常功能。肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常。绝大部分肺纤维化病人病因不明。肺纤维化严重影响人体呼吸功能，表现为干咳、进行性呼吸困难，且随着病情和肺部损伤的加重，患者呼吸功能不断恶化，存活时间仅3～5年。糖皮质激素和免疫抑制剂/细胞毒药物曾作为治疗肺纤维化的药物，但对于中晚期肺纤维化患者疗效不理想。吡非尼酮和尼达尼布对患者的肺功能下降有一定的延缓作用，但也难以逆转病程，无法真正阻止纤维化的发生。总的来看，目前针对肺纤维化全世界范围内都缺乏有效的治疗手段。目前来说，这些与肺损伤相关的肺部疾病在临床中的治疗采用的治疗手段仅能延缓疾病的进展，无法真正阻断甚至逆转疾病的进程。分析其原因，现有的治疗手段均无法修复损伤的肺部结构，因此也无法阻断或逆转这些疾病的进程。移植治疗，包括临床上应用成熟的器官移植、组织移植和新兴的细胞移植，是治疗难治性疾病和终末期器官衰竭性疾病的唯一选择。但器官和组织移植存在着不可替代的缺点：1、器官或组织来源严重不足；2、免疫排斥明显，器官或组织移植主要是同种异体移植，常常导致各种程度的免疫排斥反应，若使用免疫抑制剂治疗又增加各种机会性感染风险；3、手术时间长，技术要求高，过程复杂等。在肺病领域，全国每年能开展的肺移植手术不超过1000例，远远无法满足患者的巨大需求。因此细胞移植治疗技术，特别是在造血细胞移植、皮肤细胞移植和角膜细胞移植先后成功用于临床治疗之后，越来越受到医疗界的重视。近几年来该技术已经被运用到其他组织器官疾病的治疗中，例如皮肤细胞移植治疗烧伤，肝实质细胞移植治疗肝衰竭和其它肝代谢类疾病，角膜缘细胞移植治疗角膜损伤等。细胞移植治疗是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。为了更好地解决细胞移植过程中的排异问题，自体细胞移植治疗能够更好地解决以上问题，并具有以下优点：1、细胞来源于自身，不存在免疫排斥问题；2、移植细胞来源于成体组织器官，本身即是身体的一部分，故不存在成瘤的风险；3、细胞具有可塑性，其分裂和迁移能力活跃，在适当的环境中可以补充凋亡或坏死的同类组织或同类型细胞；4、操作简单，移植细胞不具备器官的正常外形及解剖结构，不再是一完整的器官，而是一细胞群，移植时常制成细胞悬液，无须吻合血管，因此，移植是通过各种输注途径来实现的；5、多种治疗机制，可通过迁移到组织受损部位并分化为正常组织细胞发挥修复作用，同时也通过旁分泌机制，分泌各种抗炎因子，抑制促炎因子分泌发挥作用。总之，细胞移植以其疗效良好、副作用小、更个体化、更精准等优势，目前正被运用到包括血液系统疾病、肿瘤、糖尿病、心血管病、神经系统疾病等多种疾病治疗研究中。现有技术中，经研究发现，在人体肺脏支气管基底层位置存在一群功能性的支气管基底层细胞，该群细胞表达Krt5标志基因和p63基因，具有干细胞的特性，能够不断自我更新和具有分化形成肺泡和支气管上皮组织细胞的潜能。2015年在世界级顶级学术期刊《Nature》上报道的《研究利用遗传谱系追踪的方法》，用Krt5基因驱动表达的LacZ在小鼠体内跟踪支气管基底层细胞在流感病毒感染后的增殖、迁移和分化等过程。从而证明了Krt5阳性的支气管基底层细胞的确是具有肺脏修复功能。进一步的动物试验还证实，在小鼠体内用遗传学方法特异性剔除掉表达Krt5的支气管基底层细胞，小鼠的肺脏功能不仅无法修复，反而会发生组织纤维化。由此推断，维持体内足够的支气管基底层细胞数量对修复肺脏和抑制肺损伤的发生是必需的。进一步地，对于由于支气管基底层细胞缺乏而肺脏损伤无法自然修复的肺损伤小鼠，通过支气管基底层细胞移植，可以帮助其形态结构与功能的恢复。同时，在博来霉素处理的肺损伤小鼠中，移植支气管基底层细胞的损伤小鼠的存活期明显增加。此外，在H1N1流感病毒损伤的小鼠肺损伤模型中，将支气管基底层细胞经过蓝色LacZ遗传标记之后，经气管移植到小鼠肺脏中。可观察到供体细胞在受体肺脏中大面积整合，并分化形成成熟的肺泡和支气管结构。值得注意的是，对于未发生损伤的健康小鼠肺脏，支气管基底层细胞移植完全无法成功，这在某种程度上也保障了移植的相对安全性。目前，现有技术中未出现临床级的支气管基底层细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种临床级本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种临床级自体支气管基底层细胞的制备工艺，其包括如下步骤：/n组织准备：取离体活性支气管刷检组织备用；/n酶解：对上述组织进行消化处理，终止消化后收集细胞；/n铺板、扩增培养：取部分经消化处理后的细胞，利用铺被滋养层细胞的培养板对细胞进行铺板培养，收集细胞并利用铺被滋养层细胞的培养板对其进行扩增培养，待细胞长满至培养板表面积的50％-90％时，进行传代培养；/n收集细胞：待传代培养细胞长满至培养皿表面积的85％-95％时，消化并收集贴壁细胞，洗涤即可。/n

【技术特征摘要】
1.一种临床级自体支气管基底层细胞的制备工艺，其包括如下步骤：
组织准备：取离体活性支气管刷检组织备用；
酶解：对上述组织进行消化处理，终止消化后收集细胞；
铺板、扩增培养：取部分经消化处理后的细胞，利用铺被滋养层细胞的培养板对细胞进行铺板培养，收集细胞并利用铺被滋养层细胞的培养板对其进行扩增培养，待细胞长满至培养板表面积的50％-90％时，进行传代培养；
收集细胞：待传代培养细胞长满至培养皿表面积的85％-95％时，消化并收集贴壁细胞，洗涤即可。


2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述组织消化液包含99v％的DMEM/F12，1-20ng/mL的DNA酶，0.1-4mg/mL蛋白酶XIV和10-200ng/mL胰酶；所述消化处理的温度为37℃，时间为0.5-2h。


3.根据权利要求1或2所述的制备工艺，其特征在于，所述终止液包含90v％DMEM和10v％(FBS)。


4.根据权利要求1-3任一所述的制备工艺，其特征在于，支气管刷检组织来自于至少一个部位。


5.根据权利要求1-3任一所述的制备工艺，其特征在于，对经酶解后的细胞、经铺板培养后的细胞进行冻存；
优选在冻存细胞前，进行菌检和支原体检测。


6.根据权利要求5所述的制备工艺，其特征在于，快速解冻细胞，进行铺板培养和/或扩增培养。


7.根据权利要求1-6任一所述的制备工艺，其特征在于，铺板培养包括以下步骤：
取待进行铺板培养的细胞，用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的培养板中，培养板中加入抗生素；
在37℃，CO2浓度为4％-8％条件下培养，隔天更换培养基，待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团，细胞克隆长大至超过80％的克隆中有40-100个细胞，且随机观察的5个视野中有3个视野均有A级和B级克隆时，收集细胞。


8.根据权利要求1-7任一项所述的制备工艺，其特征在于，利用铺被滋养层细胞的培养板于37℃进行扩增培养；同时对细胞形态进行观察和检测，随机观察5个视野，A级和B级克隆超过50％；
所述铺被有滋养层细胞的培养板中，滋养层细胞铺满培养板面积的50％-70％。


9.根据权利要求7或8所述的制备工艺，其特征在于，所述A级克隆轮廓规则圆滑，克隆边界清晰，克隆内细胞排列紧致，大小均一；
所述B级克隆轮廓基本规则，克隆边界平滑清晰，克隆内细胞大部分紧致均一，有少量细胞体积稍大，排列略显疏松。


10.根据权利要求1-9任一所述的制备工艺，其特征在于，所述传代培养为n次(n大于1且不大于7)，其中，利用铺被滋养层细胞的培养皿进行n-1次传代培养，至n-1次传代培养后细胞长满至培养皿表面积的50％-90％；
利用铺被基质胶的培养皿进行第n次传代后的铺板培养。


11.根据权利要求10所述的制备工艺，其特征在于，在n次传代培养中，每一次传代培养时细胞长满至培养皿表面积的50％-90％。


12.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婷，
申请(专利权)人：苏州吉美瑞生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32