本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗BCMA抗原的CAR及其表达载体、CAR细胞及应用。所述CAR包含可识别BCMA抗原的抗原识别区、铰链区，跨膜区和胞内信号域；所述识别BCMA抗原的抗原识别区为抗BCMA单链抗体，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:1‑4所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:5‑8所示。所述CAR可稳定表达于病人来源的T淋巴细胞，并且具有更好的清除肿瘤细胞的能力，可以用于制备治疗恶性血液病的药物中针对恶性血液病的过继细胞治疗；所述抗BCMA抗原的CAR细胞不仅可以有效的清除表达BCMA抗原的肿瘤靶细胞，而对阴性抗原也就是不表达BCMA的肿瘤细胞没有毒性作用，因此安全性很高。
【技术实现步骤摘要】
抗BCMA的CAR及其表达载体和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种抗BCMA抗原的CAR及其表达载体、CAR细胞及应用。
技术介绍
BCMA全称为tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember17，又称为B-cellmaturationantigen(BCMA)或CD269或TNFRSF13A，主要表达于成熟B淋巴细胞和浆细胞表面，在MM组织和细胞中高表达，是治疗恶性血液病多的合适的靶点，而发性骨髓瘤(MM)属于恶性血液病中的一种。多发性骨髓瘤又称multiplemyeloma，简写为MM，具有高度异质性和耐药性，复发概率高，目前不能治愈，已有的药物远不能解决MM患者的生存危机。而靶向CD19的CAR-T治疗在血液系统肿瘤中起到了较传统药物更优的疗效，利用CAR-T疗法治疗MM可能是一种可行并且有效的治疗方式。虽然靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞治疗在血液系统肿瘤治疗中取得了优异的成绩，但由于不同疾病所表达表面分子不同，MM细胞并不表达CD19，加之针对不同抗原不同抗体所激活的信号强度不同，因而筛选出针对MM的CAR组合仍然是CAR-T疗法治疗MM的关键点和难点。单链抗体作为CAR中重要的组成部分，其选择对CAR-T疗效起到至关重要的作用，传统的鼠源抗体，因为鼠抗的异质性会引起人抗鼠抗体反应(Humananti-mouseantibodyreaction，HAMA)，导致CAR-T在循环系统中被很快清除，失去疗效。因此，治疗用鼠源单抗需要进行人源化修饰以提高抗体的人源化程度、减弱HAMA。但是抗体的改造通常会导致抗体失去原有抗原结合活性，因此需要对抗体进行改造，而后通过大量抗原抗体结合特异性、亲和力检测，从而筛选得到具有活性的抗体序列。目前以BCMA为靶标的靶向药物的临床试验，功效均很有限并且仍有安全性问题的发生。因此，采用适用于CAR-T治疗的单链抗体(ScFv)以及筛选适合改造的人源化ScFv的CAR对于解决利用靶向BCMA的CAR-T治疗包括MM在内的恶性血液肿瘤是很有必要的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种抗BCMA抗原的CAR。所述抗BCMA抗原的CAR可以起到稳定表达于病人或健康供者来源的T淋巴细胞，并且具有更好的清除肿瘤细胞的能力，用于针对恶性血液病的过继细胞治疗。为实现上述目的，本专利技术采用以下方案：所述CAR包含可识别BCMA抗原的抗原识别区、铰链区，跨膜区和胞内信号域；所述识别BCMA抗原的抗原识别区为抗BCMA单链抗体，其重链的氨基酸序列如SEQIDNO:1，轻链氨基酸序列如SEQIDNO:5；或重链氨基酸序列如SEQIDNO:2，轻链氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；或重链氨基酸序列如SEQIDNO:3，轻链氨基酸序列如SEQIDNO:7；或重链氨基酸序列如SEQIDNO:4，轻链氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。在有些实施例中ScFv的连接方式为VH-Linker-VL，在有些实施例中ScFv的连接方式也可以是VL-Linker-VH；Linker的序列可以是：GGGGSGGGGSGGGGS也可以是(GGGGS)n其中n＝1-6，还可以是GSTSGSGKPGSGEGSTKG。进一步，所述CAR还包含前导肽序列，所述前导肽序列来源于CD8前导肽序列，氨基酸序列为如SEQIDNO:29所示。进一步，所述CAR还包含前导肽序列，所述前导肽序列来源于CD8前导肽序列，核酸序列如SEQIDNO:30所示。进一步，所述的CAR，其特征在于，所述抗BCMA单链抗体如SEQIDNO:9或SEQIDNO:10或SEQIDNO:11或SEQIDNO:12所示。进一步，所述识别BCMA抗原的单链抗体的核苷酸序列如SEQIDNO:17或SEQIDNO:18或SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示。优选的，所述识别BCMA抗原的抗原识别区核苷酸序列如SEQIDNO:17或SEQIDNO:18或SEQIDNO:20所示。进一步，所述铰链区来源于CD8或IgG4或CD7。进一步，所述铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:13或SEQIDNO:14或SEQIDNO:15或SEQIDNO:16所示。进一步，所述铰链区的核苷酸序列如SEQIDNO:21或SEQIDNO:22所示。进一步，所述跨膜区来源于CD8分子或CD28分子跨膜区；所述包内信号来源于CD28或CD137包内信号区和CD3胞内序列。进一步，所述胞内信号域的核苷酸序列如SEQIDNO:23或SEQIDNO:24所示。进一步，所述CAR的核苷酸序列如SEQIDNO:25或SEQIDNO:26或SEQIDNO:27或SEQIDNO:28所示。本专利技术的目的之二在于提供一种表达载体，具体为包含所述CAR的表达载体。所述包含所述CAR的表达载体进行T细胞转导时，CAR阳性表达率高，在病人细胞培养过程中很稳定，并且不会随着时间的推移会导致阳性率下降。为实现上述目的，本专利技术采用以下方案：所述载体选自慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体或质粒。进一步，所述载体为慢病毒载体，所述慢病毒载体含有RRE元件和oPRE元件。所述的慢病毒载体进行T细胞转导时，CAR阳性表达率高，在病人细胞培养过程中很稳定，并且不会随着时间的推移会导致阳性率显著下降。进一步，所述载体包含pUCOri序列、卡纳霉素或者氨苄青霉素抗性基因序列、SV40Ori序列、顺式元件、真核转录的启动子和CAR编码基因。具体的，所述的载体，包含用于质粒复制的原核复制子pUCOri序列；用于目的菌株大量扩增的卡纳霉素或者氨苄青霉素抗性基因序列；用于增强真核细胞内的复制病毒复制子SV40Ori序列；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；用于嵌合抗原受体基因的真核转录的启动子；以及用于组成集靶点识别、信号传递、信号启动于一体的CAR编码基因。某些实施例中，所述载体包含CAR基因的表达载体启动子采用重复的5个HRE调控元件与弱启动的CMVminiPromoter联用构成5HRE-CMVmini启动子。在某些实施方案中，载体包含左(5')逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒导出元件、可操作地连接到编码本文所涵盖的CAR的多核苷酸的启动子和右(3')逆转录病毒LTR。在某些实施方案中，CAR载体包含乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)或土拔鼠转录后调节元件(WPRE)；5'LTR的启动子经异源启动子置换，所述异源启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RousSarcomaVirus，RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。本专利技术的目的之三在于提供一种CAR细胞，具体为包含所述表达载体的CAR细胞。肿瘤细胞表面本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗BCMA抗原的CAR，其特征在于，所述CAR包含可识别BCMA抗原的抗原识别区、铰链区，跨膜区和胞内信号域；所述识别BCMA抗原的抗原识别区为抗BCMA单链抗体，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:5；或重链氨基酸序列如SEQ IDNO:2，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或重链氨基酸序列如SEQ ID NO:3，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:7；或重链氨基酸序列如SEQ ID NO:4，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种抗BCMA抗原的CAR，其特征在于，所述CAR包含可识别BCMA抗原的抗原识别区、铰链区，跨膜区和胞内信号域；所述识别BCMA抗原的抗原识别区为抗BCMA单链抗体，其重链的氨基酸序列如SEQIDNO:1，轻链氨基酸序列如SEQIDNO:5；或重链氨基酸序列如SEQIDNO:2，轻链氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；或重链氨基酸序列如SEQIDNO:3，轻链氨基酸序列如SEQIDNO:7；或重链氨基酸序列如SEQIDNO:4，轻链氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。
2.根据权利要求1所述的CAR，其特征在于，还包含前导肽序列，所述前导肽序列来源于CD8的前导肽序列。
3.根据权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述抗BCMA单链抗体如SEQIDNO:9或SEQIDNO:10或SEQIDNO:11或SEQIDNO:12所示。
4.根据权利要求3所述的CAR，其特征在于，所述识别BCMA抗原的单链抗体的核苷酸序列如SEQIDNO:17或SEQIDNO:18或SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示。
5.根据权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述铰链区来源于CD8或IgG4或CD7。
6.根据权利要求5所述的CAR，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:13或SEQIDNO:14或SEQIDNO:15或SEQIDNO:16所示。
7.根据权利要求6所述的CAR，其特征在于，所述铰链区的核苷酸序列如SEQIDNO:21或SEQIDNO:22所示。
8.根据权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述跨膜区来源于CD8或CD28。
9.根据权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述胞内信号域来源于CD28或CD...
【专利技术属性】
技术研发人员：张巍，黄霞，陈军，赵永春，赵文旭，单娟娟，徐艳敏，
申请(专利权)人：重庆精准生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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